（1）小鼠凝血時間的測定。於末次給藥1h後，摘除眼球，於載玻片兩端各滴1滴
血，血滴直徑約5mm，立即用秒表計時，每隔20s用清潔大頭針自血滴邊緣向裏輕輕挑動1次，觀察有無血絲挑起，從采血開始至剛可以挑起血絲為止，所曆時間即為凝血時間。另一滴血供最後複檢，記錄凝血時間。
（2）血小板計數測定。於末次給藥1h後，摘眼球取血2ml，用微量吸管吸取小鼠靜脈血20μl，置於盛有0.38ml，1％（1g/dL）草酸銨溶液的試管內，充分搖勻，待試管內顯透明後，在顯微鏡下計數血小板數。
（3）血小板計數方法。①上述混合液，放置4～10min，待溶液呈紅色透明，說明紅細胞已經充分溶解，充分搖勻，取1小滴加入計數池。②放置10～15min，待血小板完全下沉後，先將中央大方格移至低倍鏡視野內，再轉以高倍鏡，數5個中方格（每個中方格麵積為1mm2，深度為0.1mm，其容積=0.1mm×1mm2=0.1mm3）內的血小板數。③血小板大小形態不一致，但均呈折光的發亮淡藍色小點，大小約紅細胞的1/7～1/2，呈不規則圓形或長圓形。在計數時必須來回扭動顯微鏡微調，不要遺漏計數。④計算：5個中方格容積=0.1mm×1mm2=0.1mm3=0.1×10-6L，稀釋倍數=20，最終：血小板含量=5個中方格血小板數總和×107L-1×20=5個中方格血小板數總和×0.2×109L-1。
3.對正常大鼠凝血因子影響
（1）大鼠凝血酶原時間測定。32隻SD大鼠隨機分為4組，每組8隻，即：溶媒對照組、分別灌胃白及野生和栽培品種提取物（50mg/kg）組。每天灌胃溶媒或藥物溶液0.2ml/10g，每天1次，連續5d，於末次給藥1h後，摘除眼球，采血製備血漿備用。取編號試管（內徑為8mm），於37℃水浴中分別加入0.2mL生理鹽水，然後分別依次加入0.1mL自製凝血活酶、0.1mL的0.025mol/L的氯化鈣（CaCl2）溶液和0.1mL大鼠抗凝血漿，混勻後，立刻開始計時。
每隔2s傾斜試管1次，直至液麵不動，此記錄時間即為凝血酶原時間。實驗共做2次，取平均值。
（2）凝血活酶製備方法。將新鮮兔腦徹底除去軟腦膜及血管網，用生理鹽水洗淨，置乳缽中研碎。除去研不碎的雜質，加3倍量的丙酮，研磨0.5min（注意不要研磨太久，致成膠狀，丙酮不易分離。如已成膠狀，則需要加少量丙酮，輕輕混勻即可分離）。靜置數分鍾後，倒去上清液，再加適量丙酮，如此反複5～6次，使腦組織完全脫水成灰白色微細粉未狀。用濾紙過濾：擠去丙酮，將腦粉攤開，在空氣中幹燥成為無粘著性的顆粒狀粉未。取1.2g上述兔腦粉，依次加入14.7ml生理鹽水和0.1mol/L的草酸鈉溶液0.3mL，在45℃水浴中每隔5分鍾充分混勻，共保持15分鍾，即可使用。
（3）大鼠血漿複鈣時間（RT）測定。32隻SD大鼠，隨機分為4組，即空白對照組、白及野生和栽培品種提取物（50mg/kg）組。每天按1ml/100g灌胃溶媒或樣品溶液，每天1次，連續5d，於末次給藥1h後，摘除眼球，采血製備血漿備用。在試管中加入0.1ml枸櫞酸鈉血漿，加入0.1ml0.025mol/LCaCl2溶液，立刻開始記時。在37℃水浴中停留60～80s，取出後靜置，觀察血漿中出現彌漫性白色顆粒的時間，重複2次，取平均值。
數據處理
結果以均值±標準差（X±S）表示，以SPSS軟件進行統計分析。采用單因素方差分析（One-wayANOVA），檢驗整體性差異。隨後采用LSD檢驗進行兩兩組間比較，P＜0.05有統計學意義。
（三）實驗結果分析
1.對小鼠上消化道出血的影響
與溶劑對照組相比，白及野生和栽培品種（50，100，200mg/kg，ig）能明顯抑製上消化
道出血，減少潰瘍及出血麵積，降低潰瘍指數。
組別劑量（mg/kg）潰瘍指數潰瘍抑製率（%）
溶劑對照組1008.56±2.03--
白及野生品種505.46±2.1736.21
1004.56±1.6746.73*
2004.36±1.6749.0
白及栽培品種506.14±2.5628.27
1005.16±1.4539.72
2004.67±2.0945.44
陽性對照組12.55.93±3.1730.72
注：*P＜0.05，與溶劑對照組相比較。
對小鼠凝血時間和血小板計數影響因野生品種提取物較少，在下麵實驗中采用栽培品種提取物進行實驗，與溶劑對照組相比，栽培品種高劑量均能顯著縮短小鼠凝血時間，與溶劑對照組相比，栽培品種低劑量對血小板計數無顯著影響、中劑量、高劑量均能顯著增加小鼠血小板數量。
對小鼠凝血時間影響
組別動物數劑量小鼠凝血時間
（mg/kg）（?X±SD）（s）
溶劑對照組1052.90±8.88
栽培品種102526.40±6.02***
105031.30±4.74***
1010031.50±7.60***
注:***表示與比較溶劑對照組P＜0.001。
對小鼠血小板數量的影響
組別動物數劑量小鼠血小板計數
（mg/kg）（?X±SD）
溶劑對照組10361.30±16.32
栽培品種1025368.70±31.39
1050387.90±27.29*
10100396.40±49.47*
注:*表示與比較溶劑對照組P＜0.05。
2.對正常大鼠凝血因子影響
與溶媒組相比栽培品種中劑量、低劑量無顯著差別，高劑量能夠顯著縮短大鼠凝血酶原時間。與溶媒對照組相比，低劑量和高劑量能夠明顯縮短大鼠血漿複鈣時間，中劑量能夠顯著縮短大鼠血漿複鈣時間。
組別動物數劑量大鼠凝血酶原時間
（mg/kg）（?X±SD）（s）
溶劑對照組839.27±3.30
栽培品種樣品82537.54±4.76
85037.27±5.46
810033.16±3.67**
注：**表示與比較溶劑對照組P
組別動物數劑量大鼠複鈣時間
（mg/kg）（X±SD）（s）
溶劑對照組852.67±12.55
栽培品種82538.02±10.33*
85027.47±8.69***
810033.72±6.84**
注：*表示與比較溶劑對照組P＜0.05；**表示與比較溶劑對照組P＜0.01；
***表示與比較溶劑對照組P＜0.001。
第四節藥材質量標準提升研究
一、活性成分動態變化
（一）藥材來源
白及藥材質量標準研究的藥材由貴州省農業科學院吳明開博士提供，經其鑒定為藥典收載品種蘭科白及Bletillastriata的塊莖。按《藥材炮製規範（2010版）》白及項下炮製
方法“洗淨，潤透，切薄片，曬幹”，製成飲片。
二、白及藥材質量控製用化學對照品研究
（一）提取、分離純化工藝
白及提取工藝流程圖
藥材
粉碎，過20目篩
白及藥粉10kg
5倍量甲醇回流提取兩次，每次3小時濾過，合並濾液回收甲醇，濃縮得浸膏1.84kg加入2.5倍量水分散依次以體積比1：1的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取3次回收試劑，濃縮成浸膏共得四部分浸膏石油醚部分乙酸乙酯部分正丁醇部分水部分提取、白及藥材分離純化工藝乙酸乙酯部分經矽膠柱，SephdexLH-20柱反複分離純化得到12個結晶。
編號性狀鑒定結果
結晶1橙紅色大黃素甲醚
結晶2白色β-穀甾醇
結晶3白色胡蘿卜苷
結晶4白色丁香樹脂酚
結晶5黃色咖啡酸
結晶6白色2，7一二羥基一4一甲氧基一9，l0一菲
結晶7淺黃色2．7一二羥基一3，4-二甲氧基菲
結晶8白色未鑒定
結晶9淺棕黃色3，7二羥基-2，4二甲氧基菲
結晶10白色未鑒定
結晶11淺土黃色對羥基苯甲醛
結晶12白色未鑒定
將正丁醇部分的浸膏，經大孔吸附樹脂柱，水-乙醇梯度洗脫，其中30%乙醇洗脫部分，上矽膠柱，用氯仿：甲醇溶劑係統洗脫。其中第2部分再反複上矽膠柱。SephdexLH一20柱分離純化得到白色粉末（批號20110901）約100mg。該物質在白及中含量較高，在所收集的白及藥材中測該物質的含量達1.5%以上。擬將該物質作為白及指標成分。按《中藥新藥質量標準用對照品研究的技術要求標準》對該物質進行結構確認，純度檢查，含量測定等研究。
（二）TLC純度檢查
取本品適量，以甲醇溶解製成供試品溶液。照薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液
40μl點於三塊矽膠GF254薄層板上，使成條帶狀，分別以氯仿-甲醇-水（5：1：0.5）、正丁醇-乙酸乙酯-水（4：1：5）上層、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（3；8；5；2）10℃以下放置下層，為展開劑展開，取出。晾幹，置紫外光燈（254nm）下檢視。色譜中除主斑點外，不得顯其他雜質斑點。在噴以10%硫酸乙醇溶液。加熱至斑點清晰，色譜中除主斑點外，不得顯其他雜質斑點。
（三）紫外掃描
經過紫外掃描，發現其在223nm處有最大吸收。
（四）HPLC純度檢查
照高效液相色譜法（中國藥典）
供試品製備：取本品粉末適量，甲醇溶解並稀釋至1mg/ml。
色譜條件：色譜柱：依利特ods柱200*4.6mm，5μm檢測器為二極管陣列檢測器
流動相：A：0.02%磷酸水溶液63B：甲醇37
柱溫：40℃
流速：1ml/min
吸取供試品溶液20μl注入高效液相色譜儀，測定，即得。
本品在檢測波長200～350nm範圍內，各檢測波長所得的色譜在扣除溶劑峰以後，主
峰峰麵積歸一化結果不少於98%。
表9－24HPLC純度檢查
1:223nm，8nm
Pk#
Retention Time Area Area Percent Theoreti calplates Resolution
17.439444050.124690.650.00
28.138457100.120.000.00
38.572654290.171629.840.00
420.9893755351499.593719.8411.16
Totals
37709058100.00
（五）結構鑒別NMR
經解析該物質結構式如下，雙[4-（β-D-吡喃葡萄糖氧）苄基]-2-異丁基蘋果酸酯，為已有報道的militarine。
三、白及藥材militarine含量測定方法學研究
照《中國藥典》（2010年版）一部附錄XVIIIA中藥質量標準分析方法驗證指導原則，分別對方法的準確度、精密度、專屬性、線性及耐用性等進行了試驗。
（一）係統適用性試驗
分別取militarine對照品溶液、白及藥材供試品溶液注入液相色譜儀，記錄色譜。
militarine的保留時間（tR）約為20.0min，militarine和相近的雜質峰分離完全。理論塔板數
以militarine算為8000。經試驗，當理論塔板數達到5000時，可將供試液中militarine峰分離完全，故擬定理論塔板數以militarine計算，應不低於5000。
（二）線性關係考察
精密稱取militarine對照品13.18mg於10ml量瓶中，加甲醇適量使溶解。定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述溶液0.2、0.8、1.0、1.2、2ml於10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，取續濾液。注入液相色譜儀，測定峰麵積，記錄色譜，以峰麵積A（μV.S）對濃度C（mg/ml）進行線性回歸計算，得線性方程為：A=14582017X+58594.93，r=0.999，結果表明進樣量0.02636mg/ml～0.2636μmg/ml範圍內，線性關係良好。
（三）提取時間的選擇
分別取白及藥材細粉適量，精密稱定，分別精密加入甲醇50ml，稱定重量，分別對回流提取30、60、90、120、150、180min進行考察，從考察結果可得，回流提取120min，即可將白及藥材中的militarine提取完全。故選擇回流提取時間為120min。
（四）提取溶劑使用量考察
分別取白及藥材細粉適量，精密稱定，分別對提取溶劑加入量20、50、70、
100ml，回流提取120分鍾，進行考察，從實驗結果可得，當提取溶劑加入量為50ml，回流
得取120分鍾後即可將當歸藥材中的militarine提取完全，故選擇提取溶液加入量為50ml。
（五）精密度考察
取白及藥材細粉適量，精密稱定，精密加入甲醇50ml。稱定重量。加熱回流120min，放冷，以甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，重複進樣6次，測定峰麵積，計算含量，RSD為0.38%，結果表明精密度良好。