四、核酸的顯示法
核酸有脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）兩大類。每類核酸都是由4種單核苷酸（mononucleotide）單位組成。每種單核苷酸的組成成分是戊糖（在DNA是脫氧核糖，RNA中是核糖），磷酸根和一種含氮基（nitrogenous base）（或堿基）。由於核酸的含氮基數量很大，它們的排列順序也呈多樣性。在DNA和RNA，它們的單核苷酸是分別按一定的順序組合形成聚核苷酸鏈（polynucleotide bond）的。
DNA的4種單核苷酸是：戊糖+磷酸根+腺嘌呤（Ade），戊糖+磷酸根+鳥嘌呤（Gua），戊糖+磷酸根＋胸腺嘧啶（Thy），戊糖+磷酸根＋胞嘧啶（Cyt）。
RNA的4種單核苷酸是：戊糖+磷酸根+腺嘌呤，戊糖+磷酸根+鳥嘌呤，戊糖+磷酸根+尿嘧啶（Ura），戊糖+磷酸根+胞嘧啶。
以下分別介紹三種核酸染色，其中的Feulgen反應顯示DNA是較精確、特異性的方法。
（一）Feulgen反應顯示DNA
反應原理：此反應是根據在HCl水解的基礎上破壞嘌呤-脫氧核糖鍵釋放活性醛基，再與Schiff試劑（無色品紅，亞硫酸品紅）結合，重現雙鍵而使核染色質呈紫紅色的原理。Schiff試劑：對品紅分子加亞硫酸H2SO3，反應後，失去雙鍵而成無色品紅（Leucfuchsin）。
染色步驟：
（1）很多固定劑都可用，但Bouin固定劑不適用，因Bouin固定劑可致過度水解（氧化）。例如，組織用Carnoy液固定於4℃，6～12小時，如組織塊的厚度不超過3mm則室溫30～90分鍾，或4℃3～6小時即可。以Carnoy液固定後直入無水酒精或無水酒精：氯仿（1：1）脫水，最好經純苯透明（防組織變脆），石蠟包埋。
（2）石蠟切片4～5μm。貼片後充分烘幹。脫蠟、梯度酒精下行入蒸餾水。
（3）水解：一般均用1N HCl液於60℃作水解液。為使Feulgen反應達到最大強度，各種固定劑所需的水解時間不同，如Carnoy液、甲醛液、Helly液均8分鍾；無水酒精、Zneker液均5分鍾。水解不足將致弱Feulgen反應，過度則呈陰性結果，一般是勿超過所定時間上限的20%。
水解1N HCl液配製：濃鹽酸（含量36%～38%，比重1.19）8.5ml，蒸餾水91.5ml。操作：先在1N HCl液內（室溫）浸洗1分鍾，然後轉入已預熱到60℃的1N HCl液內8分鍾（這是指在Carnoy液內固定的組織）。嚴格控製溫度，不可低於60℃。
（4）水解後在1N HCl液浸洗（室溫）1分鍾。
（5）Schiff試劑（室溫）30～60分鍾（一般可45分鍾）。
Schiff試劑的配製：將蒸餾水200ml煮沸，停火後加入堿性品紅1g攪拌至染料全溶。待溶液冷至50℃，加偏重亞硫酸鉀（或鈉鹽）1g搖蕩溶解後冷至室溫（25℃）。又加1N HCl液20ml，充分搖蕩。在室溫暗處避光保存18～24小時，溶液呈草黃色。加新鮮活性炭2g充分搖蕩數分鍾。用濾紙過濾，濾過液應無色或淡黃色，然後盛入褐色小口瓶置於冰箱（4℃）貯存。貯存液可保持1個月，如變成淡紅色即失效。
（6）在臨用時新配的亞硫酸溶液內洗3次，每次2分鍾。
亞硫酸溶液的配製：10%偏重亞硫酸鉀或鈉鹽5ml，1N HCl 5ml，蒸餾水90ml。
（7）流水衝洗5分鍾，再蒸餾水洗。
（8）複染於1%光綠（Lightgreen）或0.5%堅牢綠（fastgreen FCF）水溶液2分鍾，（可忽略），複染後水洗。
（9）脫水，透明，封固。
結果：DNA呈紅紫色，胞質呈綠色。
注：對照片可將1N HCl液改用蒸餾水，以相同溫度及時間處理。其他各步依次進行。或切片下行入水後先用脫氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease，DNase）處理液於37℃處理幾小時後，按各步進行。DNA呈陰性反應。
脫氧核糖核酸酶處理液配製：pH7.6的0.2M Tris緩衝液10ml，雙蒸水50ml，DNase 10mg。
（二）Feulgen-萘甲酰肼反應
反應原理：應用合成出來的2-羥基-3-萘甲酰肼試劑染DNA。該試劑與醛、酮作用發生縮合反應，然後再同重氮鹽偶聯產生有色的羰基酰肼化合物。此法用於核內染色質定位與Feulgen反應顯示結果相似，細胞質的細節也能顯示出很清楚的粉紅色。這是因為此類酰肼試劑中的分子與另外一些周圍組織中蛋白質結合在一起，以後的處理是使這些蛋白質酰肼化合物變成粉紅色。
染色步驟：
（1）各種製片。
（2）切片脫蠟至水。
（3）在冷1N HCl中略洗。
（4）放入60℃ 1N HCl中水解適當時間（與Feulgen反應相同）。
（5）用冷1N HCl略洗，幹後，用蒸餾水，最後用50%酒精稍刷洗。
（6）用0.1%NAH（溶於含有5%醋酸的50%酒精中），在22℃左右處理切片3～6小時。
（7）用50%酒精洗三次，每次10分鍾。
（8）蒸餾水洗。
（9）移入新配製的重氮化鄰聯茴香胺（也可用穩定的重氮鹽堅牢藍B鹽（I.C.I.Ltd））溶液中，於0℃，pH7.4時放置1～3分鍾。
2-羥基-3萘甲酸的氯化物試劑的配製：將20g 2-羥基-3-萘甲酸同25ml亞硫酰二氯放在一起加熱，直至固體溶解。減壓蒸餾，除去過剩的亞硫酰二氯。冷後2-羥基-3-萘甲酸氯化物即固化。將固化物溶於50ml的甲醇（純）中。低壓下蒸餾除去甲醇。加35ml 85%水合肼，並在蒸氣中加熱3小時，冷卻時酰肼即結晶析出。加水，抽濾收集結晶、水洗。將結晶溶於500ml熱乙醇中，並以活性炭處理。待溶液冷後收集結晶，用乙醚洗。產出16g（70%）淺黃色小片狀晶體。溶點203～204℃。
（10）蒸餾水洗。
（11）用酒精脫水，二甲苯透明，DPX封固。
結果：DNA呈藍紫色。細胞質及其他蛋白質特別是顯強堿性的，可染為粉紅色。
（三）甲基綠－派洛寧染色顯示DNA與RNA
反應原理：甲基綠（methyl green）和派洛寧（pyroninY或G）都是堿性染料，作為DNA和RNA的分化染色是根據染料對它們的化學親和性略有區別，使在組織染色過程中顯示相當的差別。據此可知，某些組織成分適於某一pH染色，而其他組織則需另外的pH染色；但在應用兩種堿性染料希望同時表現其分化染色反應功能時，可由某一中間pH來解決。如甲基綠與派洛寧兩染料的染色，在低pH（1.5）則全為派洛寧染而呈紅色，用高pH（9.0）會使甲基綠染色突出。因此，在該兩個pH值之間，一般用適中的pH4.8使該兩染料皆起作用而呈分化狀態。由於DNA與RNA的聚合作用的程度不同而出現染色結果的差別，DNA的聚合程度高，易與甲基綠結合，如DNA解聚即可在一定程度上失去其與甲基綠的染色反而染成紅色（派洛寧著色）。正常情況下，這種混合染色中派洛寧著色常慢於甲基綠著色而出現染色過程的早期全染成綠色，經較長時間後乃漸為派洛寧代替而達到平衡。因此，混合染色應對三個因素注意控製，即染液的pH、染料濃度及染色時間。此外，甲基綠易降解成甲紫，這可以用氯仿重複換洗除去甲紫，對派洛寧也可用氯仿換洗除去雜質而使染色鮮豔。對組織的固定，用Carnoy液或AAF液較易獲良好結果。
染色步驟（Cook，L974）：
（1）組織塊厚約2～3mm用Carnoy液，在4℃冰箱內固定4～6小時。或用Lillie AAF液代替Carnoy液。
AAF液的配製：40%甲醛液10ml，冰醋酸5ml，95%～100%酒精85ml。
（2）石蠟包埋，切片4～5μm。
（3）切片按常規脫蠟，經梯度酒精至水。
（4）入0.2M醋酸緩衝液pH4.8略洗。
0.2M醋酸緩衝液pH4.8的配製：0.2M醋酸鈉（含水，MW＝136，用2.72g）（或無水，MW＝82，用1.64g亦可）加蒸餾水100ml；0.2M醋酸為冰醋酸1.2ml加蒸餾水100ml配製。取0.2M醋酸鈉液20ml，加0.2M醋酸液30ml，混合後，調節pH4.8。