不僅如此，他還冒天下之大不韙，散布批判亞裏士多德論點的言論，聲言：發現真理的道路不是靠背誦亞裏士多德的著作，而要通過學習大自然這本寶書。他公然發表與亞裏士多德論點相反的言論：輕重物體從同一高度下落，其下落速度是相同的，並同時落地；力所引起的“不是物體的運動，而是運動的改變”。這便引起了亞裏士多德的崇拜者的反對，連他的學生們由於受到蒙蔽也起哄反對他。在這種情況下，據說(無曆史考證)1590年，他做了一個轟動比薩城的實驗：將分別為10磅和1磅的鉛球從比薩斜塔的頂部同時拋下，“砰”的一聲，兩隻鉛球同時落地。結果震驚了看熱鬧的人群，也使準備看他笑話並反對他的經院派教授們目瞪口呆。盡管事實勝於雄辯，但這更激怒了那些吃亞裏士多德理論飯的人。1592年，伽利略被趕出了比薩大學，被迫去了帕多瓦，在朋友的幫助下，當上了帕多瓦大學的教授。
伽利略在比薩大學任教時寫下了《運動的對話》一文，並做了出色的實驗，提出了新的觀點，發現了“落體定律”，被具有新思想的科學家們譽為“當代的亞裏士多德”。這是他在科學研究道路上的青年期。
伽利略在帕多瓦的18年(1592～1610)是他科學生涯的形成期。在這一時期，他進一步完善了有關動力學和運動學的研究，提出了“斜麵定律”、“慣性定律”、“拋射定律”，以及相關的概念；還研究了光學問題，如光的顏色、光的本性，提出了光速恒定的觀點，設計了光速測定的實驗；此外他還研究了材料強度等問題。在儀器設備上，1593年他製造出了氣體溫度計。1608年，他得知荷蘭眼鏡商人製造了望遠鏡，對此發生了極大興趣，經過多方學習研究，於1609年製造出了放大率為1000倍、縮短距離為30倍的，由凸、凹透鏡組成的伽利略望遠鏡。這為他進行天文觀測增添了一件有力的武器，使他成果累累。同時也使他進入了曆史的是非之地，引出了與羅馬教會的論戰和抗爭。
伽利略堅信哥白尼的太陽中心說是正確的，在給開普勒的信中，他自稱是“哥白尼的信徒”。1604年，他觀察到巨蛇星座新星出現並在1年後消失，從而駁斥了亞裏士多德學派“天體永遠不變”的謬論。他利用他的望遠鏡觀察到月球表麵凸凹不平，太陽有黑子，木星有4顆衛星，銀河係由無數的恒星組成，金星、水星也有盈虧現象等。1610年，他發表了《星際使者》一書，公布了上述新發現，並宣告了天上的星星“繞太陽運行”以及地球自轉的觀察結果。1613年又出版了他的《關於太陽黑子通信集》的專著，直接批判了經院派學者所宣揚的“太陽完美無缺”、“地球是宇宙中心”的托勒玫和亞裏士多德的錯誤觀點，結果使羅馬教廷震怒。1615年，他受到宗教裁判所的傳訊和警告，裁判所宣布哥白尼學說為異端邪說，並命令伽利略停止宣傳哥白尼的學說。1623年，喜歡數理的馬伯利尼紅衣主教登上了新教皇的寶座。伽利略對其抱有幻想，於1630年發表《試驗者》論文又宣布了原來的觀點；1632年進一步發表警世之作《關於兩大世界體係的對話》，即托勒玫和哥白尼體係的對話，直接生動而有力地宣揚了哥白尼的學說，批判了托勒玫的學說，被世人譽為近代天文學三大傑作之一(另兩大傑作為哥白尼的《天體運行論》和牛頓的《自然哲學的數學原理》)。伽利略的著作直接動搖了羅馬教廷賴以支撐的教義，引起教廷的驚恐。教皇下令沒收這本書，立即逮捕伽利略。1633年2月伽利略開始被審訊，此時他已69歲，病魔纏身。曆經嚴刑拷打，已生命垂危的他，被迫在事先寫好的“認罪書”上簽了字，並於同年4月12日被判為終身監禁。據說，伽利略聽了宣判後喃喃地說：“無論如何，地球確實在運動啊!”
羅馬教廷對伽利略的摧殘和對真理的壓製，使意大利科學發展走入低穀，200餘年中很少出現大物理學家。
伽利略生命的最後9年被囚禁於阿爾契特裏郊外的一所別墅裏，不準再進行科學研究活動。此時他雙目失明，百病纏身，隻有他的學生托裏拆利和維維安尼陪伴他。就在這樣的困境下，他口述和總結了他的物理學的科研成果《關於兩門新科學(動力學和局部運動學)的談話與數學證明》。此書不僅總結了他以前的研究成果，而且形成了嚴密的科學體係，表達嚴謹，論證嚴密，數學表述準確，使實驗結果、邏輯表達和數學推證渾然一體。這本書為近代物理學的發展開創了新紀元。此書1636年完成，被秘密送往荷蘭發表，於1638年麵世。伽利略在1610年離開帕多瓦後所完成的《關於兩大世界體係的對話》和《兩門新科學的談話》兩本書標誌著他的科學思想和科學研究走向了成熟階段。他為後人留下了寶貴的遺產，而這位科學史上的“巨人”卻在滿目淒涼、貧病交加中於1642年1月8日默默地與世長辭，終年78歲。臨終時，他懷抱著《兩門新科學的談話》
這本飽含自己一生心血的書，用模糊不清的聲音說：“我認為這是我一切著作中最有價值的，因為它是我極端痛苦的果實。”
愛因斯坦和英費爾德在《物理學進化》中評論說：“伽利略的發現以及他所應用的科學推理方法是人類思想史上最偉大的成就之一，而且是標誌著物理學的真正開端。”如果說，開普勒發現了天上行星運行的三定律的話，那麼伽利略發現了地上物體運動的三定律：自由落體定律、慣性定律和拋體運動定律。與這三定律相聯係的還有勻速運動、勻加速運動、瞬時速度、加速度等概念和運動獨立性原理、相對性原理、疊加性原理，以及運動的分解、合成和平行四邊形法則等。