一、蜂毒的提純技術
1.蜂毒的去雜精製
(1)將含雜質的蜂毒溶於10倍的蒸餾水中。
(2)將蜂毒水溶液經中速定性濾紙過濾,除去塵土、蠟鱗等水不溶物。
(3)於蜂毒濾液中加入1.5~2.0倍的丙酮,使蜂毒沉澱析出;再經離心分離,傾出上清液,除去溶於其中的花蜜等。
(4)分離出的沉澱物為蜂毒,采用熱風幹燥處理後,裝瓶密封。
2.蜂毒的脫脂、脫色精製
(1)將含雜質的蜂毒溶於10倍的蒸餾水中。
(2)按質量百分比,於蜂毒水溶液中加0.5%的活性炭進行吸附,經中速定性濾紙減壓過濾,得澄清透明的蜂毒水溶液。
(3)將澄清透明的蜂毒水溶液置於連續液-液萃取裝置中填充有小瓷圈的長玻管內,於玻管上方的球形漏鬥內加入三氯甲烷,開啟球形漏鬥的閥門,讓三氯甲烷慢慢滴入長玻管內,在沉降過程中與蜂毒水溶液充分接觸,萃取其中的脂類物質。當三氯甲烷沉降至長玻管底部時,開啟長玻管底部的閥門,緩緩放出已與蜂毒水溶液充分接觸並已萃取了其中脂類物質的三氯甲烷,直至蜂毒中脂類物質脫盡為止,放盡三氯甲烷後,關閉球形漏鬥的閥門。再倒出脫脂後的蜂毒水溶液。
(4)於脫脂後的蜂毒水溶液中加入1.5~2.0倍的丙酮,使蜂毒沉澱析出,經離心分離,傾出上清液,使溶於其中的糖、酸等被除去;再加入10倍蒸餾水,溶解沉澱析出的蜂毒,重新加入1.5~2.0倍的丙酮,又使蜂毒沉澱析出,離心分離,進一步除去糖、酸等物質,此操作重複進行2~3次。
(5)脫脂、去除糖分和酸類物質後的蜂毒再經熱風幹燥處理後裝瓶密封。
二、蜂毒肽的分離純化
蜂毒肽是蜜蜂毒素中的主要多肽組分,約占蜂毒幹重的50%,它具有廣泛的生理活性。以前的研究主要集中於其抗炎、鎮痛等活性範圍,臨床上曾用於治療風濕、類風濕關節炎及神經痛,療效較理想。通過蜂毒組分的分離,得較純的蜂毒肽,可用於抗腫瘤及抗凝血活性的探討。
1.分離方法
(1)去糖:將脫脂的精製蜂毒溶於0.1mol/L(pH4.5)的甲酸銨溶液中,使之經過凝膠色譜柱係統,再使用0.1mol/L(pH=4.5)的甲酸銨溶液作為流動相,流速36mL/h,經280nm紫外檢測,收集蜂毒肽流出部分,經多次重複操作可獲得足夠數量的蜂毒肽組分,脫鹽後凍幹。
(2)純化:采用離子交換法,提取蜂毒純品,經過SP-Sephadex C25柱,用0.01mol/L(pH5.48)~2.5mol/L (pH5.55)的甲醛銨溶液濃度梯度洗脫,流速為150mL/h,收集蜂毒肽部分,脫鹽、凍幹,即可得到蜂毒肽純品。
2.蜂毒肽的檢測
采用毛細管電泳法對所得的蜂毒肽純品及標準品的純度同等加以檢測。
(1)分析條件:20kV,214nm,H3PO4-H2PO4溶液(pH2.44)。
(2)石英毛細管:直徑75μm。
(3)使測定結果確定蜂毒肽純度。
磷脂酶A2、透明質酸酶等組分可采用與蜂毒肽同樣的原理及方法取得。
三、蜂毒產品的加工技術
蜂毒產品是指以蜂毒為原料加入輔料製成的內服或外用型產品。目前國內蜂毒產品主要應用於治療軟組織、結締組織炎症(如關節炎、類風濕性關節炎)等疾病,也有對蜂毒進行分離提純將其中的活性成分提取出來應用於研究和臨床。