正文 第四章 家蠶性別與生長發育模式(3 / 3)

家蠶5齡期血液中有兩群主要的蛋白質,其中一群為低分子量脂蛋白(lowmolecularweightlipoprotein,LP),這些蛋白質的分子量約30kDa,因此被稱為家蠶30K蛋白。30K蛋白是家蠶5齡初期以後血液中最多的一種蛋白質。研究發現,雌蠶中大量的30K蛋白被卵母細胞攝取,使卵中30K蛋白的含量達到了卵黃蛋白的35%。迄今已經確定了家蠶中部分30K蛋白基因的座位,一些蛋白的基因已被克隆,研究還顯示這些蛋白的合成由昆蟲激素調控。關於30K蛋白的功能也有若幹的研究,鍾伯雄等通過對不同品種的家蠶卵黃蛋白進行雙向電泳結果的分析,認為發現該蛋白可能對家蠶的胚胎發育具有重要的功能;而Minoru等發現家蠶蛋白可以結合葡萄糖和葡聚糖,具有載脂蛋白功能,並且它可能參與到家蠶的自我防禦體係中。對純化的家蠶蛋白研究發現,它不僅可以抑製家蠶細胞的程序性死亡,並且可以抑製人細胞的程序性死亡。因此30K蛋白是闡明昆蟲基因表達調控機理最理想的模式體係之一。

七、蛋白酶抑製劑蛋白酶抑製劑

蛋白酶抑製劑(proteinaseinhibitor,PIproteinaseinhibitor,PI),是一種抑製蛋白酶分解活性的蛋白質,普遍存在於動物、植物和微生物中。蛋白酶抑製劑能抑製蛋白酶活性,在調控蛋白酶參與的生理生化活動中起著重要作用。1936年Kunitz等首先從牛胰髒中分離出堿性胰蛋白酶抑製因子(basicpancreatictrypsininhibitor,BPTI,也稱Kunitznorthrop型抑製因子)。隨後,在自然界發現了多種PI。根據其起作用的蛋白酶主要分為以下幾類:抑製胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的絲氨酸蛋白酶抑製劑;抑製木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等的巰基蛋白酶抑製劑;抑製胃蛋白酶、組織蛋白酶D等的羥基蛋白酶抑製劑和抑製膠原酶、氨肽酶等的金屬蛋白酶抑製劑等。其中,絲氨酸蛋白酶抑製劑和巰基蛋白酶抑製劑在昆蟲的生長發育及變態發育過程中起著重要的作用。

Kang等從果蠅中純化了一種可以抑製牛α胰凝乳蛋白酶及蚊成蟲的胰凝乳蛋白酶活性的蛋白酶抑製因子。Suzuki等從麻蠅中發現可以抑製血球半胱氨酸蛋白酶活性的蛋白酶抑製因子。Kanost等從煙草天蛾幼蟲血液中純化了4種絲氨酸蛋白酶抑製因子。森田等從家蠶幼蟲血液中純化了對胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶活性有抑製作用的蛋白酶抑製因子。Fujii等報道家蠶體液中至少有16種胰凝乳蛋白酶抑製因子。Sasaki從家蠶血液中純化了3種以1∶1活性抑製牛α胰凝乳蛋白酶和胰肽酶的蛋白酶抑製因子。Eguchi等從家蠶血液中分離純化了5種蛋白酶抑製因子。另外,從人體血液及體液、中國天蠶、柞蠶、蓖麻蠶、蟑螂、蚊子、舌蠅中也發現了蛋白酶抑製因子。

家蠶胰凝乳蛋白酶抑製劑的種類因品種不同而異。利用聚丙烯酸胺凝膠電泳和CI活性染色在家蠶中發現了CIb1、CIb2、CI1、CI2、CI2′、CI9、CI10、CI13、CI13′、CI3、CI4、CI5、CI6、CI6′、CI7和CI8等凝乳蛋白酶抑製因子。CI1和CI2由家蠶血液中分離,分子量分別約為10.4kDa和7.9kDa,pI分別是7.12kDa和7.00kDa。Fujii等從血液中分離到CI13,測得分子量和pI為14kDa和4.1kDa。Shirai等從血液中分析純化到了CI8蛋白。Eguchi等調查了家蠶4齡到蛹期血液中CI的總活性。Aratake等檢測了從家蠶3齡幼蟲到成蟲血液中CI總活性,發現在幼蟲期,5齡以前CI保持較低的總活性,從5齡第2天開始總活性迅速增加,到吐絲時達到最大,蛹期又迅速降低,在蛹後期和成蟲中保持低的活性,雌雄之間CI的總活性差異不大。不同家蠶品種中,當CI總活性較低時差異不大,當5齡後期活性高時,活性差異可達4倍。裘智勇等研究發現,血液中CI8的濃度在5齡第2天開始增加,吐絲開始時達到最大,呈單峰變化,雌、雄間差異不大。但在脂肪體中CI8濃度的變化有2個峰,分別在5齡4天(雌)或5天(雄)和蛹3天。血液和脂肪體中CI8濃度的變化趨勢不相一致,表明血液中的CI8又回到脂肪體,並貯存於蛋白顆粒中。官建研究發現血液中CI8在蛹期的表達量要明顯高於蛾期,可能是蛹脂肪體蛋白顆粒重新釋放CI8到血液中,為羽化作準備。

第三節家蠶性別與生長發育

一、不同品種、性別與發育

蘇卵限蘇卵限不同性別生長發育:蘇卵限是在卵期可以分辨雌雄的品種,可以在卵期就將幼蟲分為雌雄兩組進行之後的實驗。依據蘇卵限蠶卵的顏色將家蠶分為雌、雄兩組,正常飼養記錄每天的體重和各齡期發育時間。

在家蠶整個幼蟲生活時間裏,無論雌組還是雄組都要經曆兩個快速生長發育期。“S”形曲線在用於描述生物生長時,曲線的形狀會因生物的性別、種類、飼養條件等因素而有所不同。而Richards曲線方程y=A(1-Be-kt)1/(1-m)隨著參數m的改變該方程可以涵蓋多種類型的曲線方程,因此Richards模型可用於描述很靈活的曲線。本研究用SPSS軟件對家蠶體重和發育時間進行Richards模型的參數估計,得到k,t,m3個參數,進而估計出雌、雄兩組家蠶進入快速生長發育期的時間。雌組家蠶進入第1個快速生長發育期的時間比雄組快12小時,而在進入第2個快速生長發育期時隻比雄組快4小時,即家蠶在進入4齡之前雌組需要的發育時間短於雄組,而從4齡至吐絲雌組需要的發育時間則長於雄組。因此,筆者推測,在第1個快速生長發育期前,雌組的發育速率比雄組高;而在第1個快速生長發育期後,雄組的發育速率則快於雌組。

菁鬆和褐圓瀛翰不同性別生長發育:實驗嚴格控製各組一致的培養條件,在每次蛻皮前後根據眠起時間和發育速度的不同將家蠶分為快、中、慢3組。並在菁鬆和褐圓瀛翰4齡和5齡時,分別統計快、中、慢3組中雌蠶和雄蠶的比例。

在快組中(即起蠶時間最早的實驗組),菁鬆雌、雄家蠶的頭數比例為2,說明此時快組中雌蠶較多,從另一個側麵說明在這個階段雌蠶的發育較快。兩種家蠶在4齡前的發育進程中,發育較快的個體大多是雌蠶,而發育較慢的個體大多是雄蠶,但在4~5齡期則表現相反,雄蠶發育快,雌蠶發育慢。

二、家蠶不同性別、齡期血淋巴上清液的蛋白含量

血淋巴蛋白濃度含量測定排序:4齡雄組

第四節家蠶雌雄血淋巴差異蛋白質組學

對各組家蠶血淋巴進行蛋白定量,進行二維電泳分析,選取差異點進行MALDITOF質譜鑒定,結果在Mascot網站進行在線比對,最後鑒定到40個差異蛋白。用PDQuest軟件對這些差異蛋白在凝膠上的蛋白點體積進行對比分析,由生成的三維視圖可見,這些蛋白點都存在顯著差異。

鑒定得到的這40個蛋白中,22個蛋白來自於3齡家蠶組,18個蛋白來自於5齡家蠶組。與雄組相比,在3齡家蠶血淋巴樣品中雌組表達下調的有4個蛋白,即為血淋巴保幼激素結合蛋白前體血淋巴保幼激素結合蛋白前體(hemolymphjuvenilehormonebindingproteinprecursor)、血淋巴蛋白、27K蛋白前體(p27Kprecursor)和假定的表皮蛋白(TPA:putativecuticleprotein)。而表達上調的有15個蛋白,即β1,3葡聚糖識別蛋白(β1,3glucanrecognitionprotein)、絲氨酸蛋白酶樣蛋白(serineproteinaselikeprotein)、βN乙酰氨基葡萄糖苷酶2βN乙酰氨基葡糖苷酶2(βNacetylglucosaminidase2)、抗凝乳蛋白酶前體(antichymotrypsinprecursor)、胰凝乳蛋白酶抑製因子(chymotrypsininhibitorCI8A)、脂多糖結合蛋白(lipopolysaccharidebindingprotein)、氨基酰化酶(aminoacylase)、鋅指蛋白樣蛋白(similartozincfingerprotein)鋅指蛋白樣蛋白(similartozincfingerprotein)、果糖二磷酸鹽醛縮酶(fructosebisphosphatealdolase)、成蟲盤生長因子(imaginaldiskgrowthfactor,IDGF)、家蠶幼蟲貯存蛋白(BmLSPT)、載脂蛋白Ⅲ(apolipophorinⅢ)、肽脯酰胺異構酶B(peptidylprolylisomeraseB)。與雄組相比,在5齡家蠶血淋巴樣品中雌組表達下調的有5個蛋白,包括scolexin、27K蛋白前體、血淋巴保幼激素結合蛋白前體、胰凝乳蛋白酶抑製因子(chymotrypsininhibitorSCIⅡ)和多結合蛋白(multibindingprotein)。而表達上調的有12個蛋白,包括芳基貯存蛋白(arylphorin)、性別特異性貯存蛋白2(sexspecificstorageprotein2)、性別特異性貯存蛋白1(sexspecificstorageprotein1)、成蟲盤生長因子(imaginaldiskgrowthfactor)成蟲盤生長因子(imaginaldiskgrowthfactor)、低分子量脂蛋白30K前體(lowmolecularlipoprotein30Kprecursor)、成熟的30K脂蛋白(mature30Klipoprotein)、低分子量30K脂蛋白21G1(lowmolecularmass30kDalipoprotein21G1)、低分子量30K脂蛋白19G1(lowmolecularmass30kDalipoprotein19G1precursor)、主要血漿30K蛋白(majorplasmaprotein30K)、轉鐵蛋白(transferring)、抗胰蛋白酶前體(antitrypsinprecursor)和載脂蛋白Ⅲ。