第一節 病毒的純化
一、病毒繁殖
家蠶品係C108是一種對BmNPV敏感的品係（LD50=3.4×102 多角體/幼蟲）。家蠶幼蟲用新鮮桑葉飼養到5齡起蠶，保持12小時光照/12小時黑暗的光周期。BmNPV （鎮江株） 添食濃度為5×102多角體/幼蟲。7天後，收集感染的幼蟲用於病毒純化。
二、病毒純化
許多病毒能夠整合宿主細胞來源的蛋白，純化ODV避免宿主蛋白的汙染才可以進行蛋白質組學研究。ODV病毒粒子是包裹在一個厚的多角體蛋白外殼裏。首先用差速和密度梯度離心純化了多角體，並用HgCl2使蛋白酶失去活性。多角體懸浮在0.01 mol/L HgCl2，0.1 mol/L Tris（pH 7.8） 的緩衝液中，蛋白的終濃度為4 mg/ml，然後置於室溫30分鍾。過量的蛋白酶抑製物通過差速離心和在Tris緩衝液中洗滌3遍來去除。ODV病毒粒子通過堿裂解法從多角體中釋放，用連續蔗糖密度梯度離心的方法純化ODV病毒粒子。多角體被離心至管底。離心後收集多角體，用光學顯微鏡在1000倍條件下觀察多角體（圖641）。多角體沒有任何的微生物或是其他汙染。然後ODV病毒粒子使用堿處理從多角體中釋放出來。其他蛋白和多角體通過離心而去除。最後通過連續蔗糖密度梯度離心純化了ODV。在離心管中有多個條帶，選擇和提取了1個主要條帶進行下一步的試驗。
三、病毒PCR擴增鑒定
為了保證純化的病毒粒子的均一性，對純化的病毒粒子進行PCR擴增，使用2對引物來檢查病毒粒子是否含有在純化過程中殘留的家蠶細胞碎片。Ⅰ對引物是根據BmNPV的vp39基因（NCBI登錄號：1488704）來設計的。由此引物擴增的目標產物是1個大約1.2 kb長的片段。正向引物序列是：5′ GAGCTCGTTTCTAATC 3′，反向引物序列是：5′ ATGGCGCTAATGCCCG 3′。Ⅱ對引物是根據家蠶的1個DNA片段（NCBI登錄號：AY380834）來設計的，由它擴增後的目標產物是1個1.7 kb的片段。正向引物序列是：5′ CAATATCGGAGTCATTG 3′，反向引物序列是：5′ AACTCATGGAAGGCTGC 3′。另外，用家蠶的基因組DNA作為對照。
第二節SDS PAGE和2 DE分離
一、SDS PAGE
純化的病毒粒子通過懸浮於含有β硫基乙醇和十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）的10 mmol/L Tris HCl 緩衝液中變性，並加熱至95°C 10分鍾。變性的ODV蛋白用12%的SDS PAGE凝膠電泳，在50V電壓下分離15分鍾，100 V電泳1.5小時，使用的電泳係統是Protean Mini gel system （Bio Rad）。電泳結束後在去離子水中洗20分鍾最後用bio safe （Bio Rad）染料根據說明書進行染色。凝膠再用去離子水脫色45分鍾，換2遍去離子水。考馬斯亮藍染色後，蛋白條帶切取用於質譜鑒定。
ODV蛋白通過SDS PAGE進行分離，並切取條帶用於質譜鑒定12種蛋白，即多角體蛋白、P25、P49、P74、VP39、VP80、P78/83、ODV E56、ODV EC43、GP41/40、orf54和orf94。但還有5個蛋白條帶鑒定是不屬於BmNPV編碼的蛋白，這些蛋白可能是來源於宿主的細胞蛋白。
二、二維電泳（2DE）
適量病毒粒子懸浮於0.3 ml含有7 mol/L尿素、2 mol/L硫尿、4% CHAPS、0.2% Bio Lyte（pH 3~10）、1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA 和 65 mmol/L DTT（pH 8.5）的裂解緩衝液中。溶液超聲 3分鍾後進行離心（12000g，30分鍾）。蛋白濃度用Bradford法測定。用7 cm （pH 3~10） IPG 幹膠條在20℃根據Protean IEF Cell （Bio Rad）儀器說明書進行等電聚焦。大約 0.2 mg 蛋白被加入膠條。膠條在50V被動水化13小時。等電聚焦設定了一個梯度電壓的模式程序，開始分別用250V、500V、1kV和4kV 聚焦各1小時，然後在4kV聚焦至 10kV。聚焦好的膠條在含 6 mol/L尿素、375mmol/L Tris HCl、20% 甘油、2% SDS 和微量溴酚藍的緩衝液中平衡15分鍾，其中溶液中另外含有的DTT隨後替換為碘乙酰胺再平衡一次。平衡好的膠條被轉移到12% 的SDS PAGE凝膠上，在2.5 W電泳10分鍾，15 W 至溴酚藍到達凝膠的底部。電泳結束後凝膠用考馬斯亮藍進行染色，再用圖像掃描儀ScanMaker 9700XL（MicroTek）掃描。