運用代謝組學技術研究發現炮製引起大黃多成分變化
製劑與炮製
作者：趙楠 張曉哲 胡昌江 賈天柱 肖紅斌
[摘要]利用代謝組學技術，對大黃全成分進行對比分析，研究生熟大黃各類化學成分的變化。應用超高效液相色譜-四級杆-飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF）聯用技術，獲取大黃生品和熟品的色譜和質譜信息，采用多元統計分析技術對提取的324個特征峰進行比較分析。炮製大黃非靶向代謝組學研究中，發現大黃生品和熟品化學成分明顯不同，與生大黃相比，炮製後有127個成分發生顯著變化，其中125個成分含量降低，2個成分升高。該研究鑒定了其中的10個化合物，另外推測了其他23個成分的結構類型，其中15個為鞣質類，8個為蒽醌類，炮製均使它們含量降低。炮製大黃靶向代謝組學研究發現炮製使蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃素甲醚含量降低。炮製顯著影響大黃中多種成分的含量，代謝組學研究能夠比較全麵地揭示這種變化。
[關鍵詞]超高效液相色譜-四級杆-飛行時間質譜；大黃；代謝組學；炮製
中藥大黃是最常用藥材之一，中醫臨床常用炮製品入藥，以熟大黃居多。熟大黃為大黃的幹燥根及根莖以酒蒸或酒燉法炮製而成，其瀉下力緩，瀉火解毒[1]。熟大黃炮製過程本質上為加熱過程，炮製後化學成分可能會發生部分成分的熱降解或其他變化，從而導致藥性藥效的變化。因此，生、熟大黃化學成分的變化與功用的相關性研究具有重要的科學意義。目前報道[2-7]均未有從整體角度出發對大黃炮製前後化學成分進行整體研究。本文運用以生、熟大黃樣本整體為分析目標的代謝組學方法，不局限於研究常見的幾種化合物的變化，因為它們未必是大黃生熟異用的物質基礎，而是對炮製前後大黃進行全譜數據分析，從大黃化學成分中找尋受炮製影響顯著的化學成分。
1材料
Agilent 1290 Infinity-6520 Q-TOF LC-MS System。色譜純甲醇為天津市科密歐化學試劑有限公司產品，色譜純乙腈為Spectrum Chemical Mfg.Corp.產品，色譜純醋酸為天津市科密歐化學試劑有限公司產品，水為Milli-Q超純水。
生、熟大黃均由成都中醫藥大學提供，經成都中醫藥大學胡昌江教授鑒定為藥用大黃Rheum officinale Baill.的幹燥根莖，生大黃產地為四川，熟大黃120 ℃高壓蒸製3 h，每100 g大黃加30 mL黃酒。
2方法
2.1樣品溶液的製備
本實驗以同一產地不同批次大黃生品和熟品為研究對象（7個批次），精密稱取各個批次生大黃和熟大黃幹燥粉末各1.00 g，每份藥材粉末加入50%甲醇10 mL，浸泡16 h後樣品超聲提取30 min，3 000 r·min-1離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，待UHPLC-Q-TOF分析。
2.2超高效液相色譜-質譜聯用分析條件
生、熟大黃全譜分析采用Agilent 1290超高效液相色譜係統串聯6520 Q-TOF-MS。實驗采用Agilent 公司ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（3.0 mm×150 mm， 1.8 μm），流動相0.1% 醋酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～15 min，5%～100% B，流速0.4 mL·min-1，柱溫40 ℃，進樣量1 μL，檢測波長280 nm。質譜采用ESI離子源，負離子模式下采集數據，數據采集範圍m/z 100～1 500，溫度350 ℃，幹燥器流速8 L·min-1，霧化氣壓力 275.86 kPa，毛細管電壓3 500 V，Fragmentor電壓200 V，skimmer電壓 65 V。
2.3數據處理
獲取UHPLC-MS指紋圖譜後，采用軟件XCMS進行特征峰提取，最終得到一個保留時間、質荷比和峰強度的三維數據矩陣。把數據矩陣導入軟件MetaboAnalyst2.0中，采用主成分分析（PCA）得分圖直觀的表示炮製前後組間差異；通過偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）的VIP值篩選炮製前後變化顯著的化學標誌物；找到的化學標誌物通過Metlin代謝組學數據庫（http：//metlin.scripps.edu/index.php）鑒定。
2.4化合物的鑒定
本實驗通過一級質譜確定精確相對分子質量，二級質譜獲得斷裂信息，結合Metlin搜索及已報道文獻來推測化合物。
3結果與討論
3.1數據的獲取與處理
代謝組學通過比較對照組和實驗組的代謝組（metabolomes，某一生物的所有代謝物組分）以尋找代謝譜的差異。代謝組學得到的是大量、多維的信息，為確保質譜信息的質量，本研究進行了樣品提取和質譜分析的優化，獲得了高重複性的數據。為降低係統引起的誤差，使用了多樣品的等量混合液作為參比溶液，然後每個樣品的質譜信息與該參比溶液的質譜信息進行歸一化處理。隨後，應用一係列的化學計量學方法對數據進行分析，通過模式識別技術判斷大黃炮製前後的變化，深入分析了炮製後大黃中各成分的變化趨勢，並對炮製後變化顯著的化學成分進行鑒定或結構類型的推測。
大黃所含化學成分複雜，主要包括蒽醌、鞣質及其苷類等多種成分，因此建立一種快速、高通量的分析方法是十分必要的。本研究采用安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm， 1.8 μm）色譜柱，乙腈-0.1%醋酸溶液體係梯度洗脫，建立了快速的UHPLC同時檢測多種類成分，在15 min內實現了對大黃樣品的全譜分析。
可以看出生大黃和熟大黃在化合物含量（量）和組成（質）上都有差別，與生大黃相比，熟大黃的絕大部分主成分含量明顯下降。因此對其進行多元統計分析，以更加係統、準確和客觀地在大黃中找到受炮製影響顯著的化學成分。
UHPLC-MS原始數據不能直接用於後續的數據分析，必須經過峰判別、峰對齊和歸一化等前處理步驟。本文采用XCMS軟件對樣本進行特征峰提取，最終提取了包含756個特征峰的三維矩陣（峰序列號、樣本號、峰強度），經t檢驗發現其中有543個特征峰具有統計學意義（P﹤0.05）。通過合並當中的同位素峰，最終得到了含有324個特征峰的三維矩陣用於所有的後續數據分析。
3.2炮製大黃代謝組學研究
大黃含有蒽醌、蒽酮、鞣質和多糖等多種化學成分。在炮製大黃化學成分研究方麵，普遍認為炮製使大黃中結合蒽醌和鞣質減少。田國芳和張村等分別研究大黃5種炮製品（生、酒、醋、熟、炭）中蘆薈大黃素-3-CH2-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷[2]和蘆薈大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷[3]變化規律發現，熟片、炭片含量較生片下降明顯。郭東豔等[4]對大黃不同炮製品中鞣質含量測定發現炮製後鞣質含量均有不同程度的降低。目前對大黃炮製後遊離蒽醌的變化趨勢未取得一致的結論，甚至出現截然相反的結果。李先瑞等[5]采用酸水解法結合高效液相色譜研究了炮製對大黃5種遊離蒽醌的影響，結果與生大黃相比，熟大黃5種遊離蒽醌都有所下降。張村等[6]以HPLC直接測定大黃5種不同飲片中遊離蒽醌進行比較研究，發現與生片比較，5種遊離蒽醌在熟片、炭片中含量明顯增加，而醋片、酒片中含量下降。李會芳等[7]研究大黃炮製後主要化學組分的變化規律表明遊離蒽醌：熟大黃>酒大黃>生大黃>大黃炭，其中與生大黃相比，熟大黃的蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚含量增加，大黃酸、大黃素甲醚含量降低；結合蒽醌和鞣質：生大黃>酒大黃>熟大黃>大黃炭。