硫磺熏蒸金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物產生的機製探討
化學
作者：郭愛麗 高慧敏 陳兩綿 張啟偉 王智民
[摘要]為了探討硫磺熏蒸金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物的生成機製，該研究采用柱色譜技術從未硫熏金銀花中目標性製備分離了斷馬錢子酸以進行後續模擬反應，斷馬錢子酸在有水條件下與二氧化硫反應生成了其亞硫酸衍生物，反應機製可能涉及了斷馬錢子酸的酯化反應或者是酸化開環後亞硫酸根對羰基的加成反應。該研究為支持硫磺熏蒸導致金銀花中斷馬錢子酸轉變成其亞硫酸衍生物提供了實驗依據。
[關鍵詞]硫磺熏蒸；金銀花；斷馬錢子酸
金銀花為常用大宗中藥材，來源於忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb. 的幹燥花蕾或待初開的花，自1963年為曆版《中國藥典》所收載。金銀花具有清熱解毒，疏散風熱之功效，用於癰腫疔瘡，喉痹，丹毒，熱毒血痢，風熱感冒，溫病發熱等[1]。其化學成分包括揮發油、酚酸（主要為綠原酸及其衍生物）、環烯醚萜（斷馬錢子酸、馬錢苷、當藥苷及其衍生物）和黃酮類（蘆丁、木犀草苷等）。現代藥理研究表明金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、增強免疫力、解熱抗炎和利膽保肝等作用[2]。傳統的產地加工方法有曬幹和陰幹，現代加工方法有烘幹、水蒸氣幹燥、熱風幹燥以及熱風-微波聯用等，1995年版《中國藥典》曾收載過硫磺熏蒸的處理方法，在2000年版之後的《中國藥典》均取締了該產地加工方法，然而，在某些主產區，有時仍會采用硫磺熏蒸以獲得良好的外觀色澤和防止蟲蛀。前期研究表明硫磺熏蒸能夠導致金銀花中環烯醚萜類主成分斷馬錢子酸1的含量降低，同時生成其亞硫酸衍生物2～4[3]。斷馬錢子酸是一種分子結構中具有半縮醛羥基的環烯醚萜類成分，為金銀花含有的環烯醚萜類物質中的主要成分[4]，含量遠遠高於馬錢苷和當藥苷及其二聚產物，其含量的變化有可能會引起金銀花與環烯醚萜類成分相關的藥理活性的改變，譬如抗炎、抗病毒、保肝利膽等。為了進一步驗證硫熏金銀花中斷馬錢子酸亞硫酸衍生物的生成機製，該研究采用柱色譜技術從未熏金銀花中目標性製備斷馬錢子酸作為反應底物，將其在有水條件下與SO2反應，TLC和HPLC監測反應進程，基於LC-MS提供的質譜信息，與文獻數據比對，鑒定生成的化合物結構。
1材料
Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）、Agilent 1200-6130係列液相色譜-質譜聯用儀（Agilent Technologies）、大容量冷凍離心機（DL-6MB， 長沙英泰儀器有限責任公司）、SIGMA 1-14小型離心機（Germany）、EYELA N-1100旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司）、裕華HH-S型水浴鍋（鞏義市裕華儀器有限責任公司），HZ85-1型磁力攪拌器（北京中興偉業儀器有限公司）、三口瓶、雙連球等。
色譜甲醇、色譜乙腈（Fisher， USA），娃哈哈純淨水（杭州娃哈哈集團有限公司），其他試劑均為分析純。
新鮮的金銀花於2012年5月采自山東濟南，經中國中醫科學院中藥研究所王智民研究員鑒定為忍冬科植物忍冬L. japonica的花蕾。曬幹樣品：新鮮金銀花攤開晾曬於太陽下至幹燥即得；硫磺熏蒸樣品：新鮮金銀花攤開放於支架上的透氣金屬網篩中（不宜太厚），支架下端用鐵質器具裝入一定量硫磺粉末，點燃硫磺粉末出現藍紫色火焰，將整個裝置用塑料布密封，使硫磺黃色煙霧充滿裝置，熏製過夜，熏製後的金銀花晾於陰涼處，陰幹即得。
2方法與結果
2.1斷馬錢子酸的分離製備
前期研究表明，曬幹金銀花樣品中斷馬錢子酸的含量較高[3]，因此選擇曬幹樣品進行該化合物的目標性分離製備。幹燥的金銀花樣品（粉碎，311 g）用17 L 50%乙醇滲漉提取，滲漉液回收溶劑至無醇味（約2 300 mL），離心（3 500 r·min-1，20 min），上清液（約2 100 mL）上HPD-100大孔吸附樹脂柱，依次用5倍柱體積的水，10%，20%，30%，40%，95%乙醇洗脫，TLC和HPLC進行流分檢查，20%，30%乙醇洗脫部分富集斷馬錢子酸，合並後得10.3 g固體粉末，上矽膠柱（300～400目，氯仿-甲醇-水15∶4∶0.4）進行粗分，ODS柱純化（10%甲醇洗脫），得到單體化合物（277 mg）。經HPLC麵積歸一化法檢測其純度為94%；經HPLC比對保留時間，在線紫外吸收以及質譜數據，確證該化合物為斷馬錢子酸。曬幹金銀花50%甲醇超聲提取液和斷馬錢子酸在同一色譜條件下的HPLC。Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為1.4 %甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，3%～8% B；20～45 min，8%～15% B；45～60 min，15%～24% B；60～70 min，24%～40% B），檢測波長254 nm，流速 1 mL·min-1，進樣量10 μL，柱溫30 ℃。
2.2斷馬錢子酸在有水條件下與SO2反應
新鮮的金銀花經硫磺熏蒸後斷馬錢子酸1大部分被破壞，生成其亞硫酸衍生物2～4[3]，推測是斷馬錢子酸結構中的半縮醛基團與熏蒸過程中硫磺燃燒產生的SO2在有水的條件下發生反應所致；同時通過2007，2012年采集製備的硫磺熏蒸金銀花樣品的HPLC圖比對發現，在不同批次樣品中化合物2～4的含量比例不同[3，5]，推測是熏蒸過程中斷馬錢子酸與SO2接觸程度不同。因此，開展了以下實驗進行驗證。
2.2.1 反應1 Na2S2O3溶液（3 mol·L-1）與H2SO4（3 mol·L-1）水浴40 ℃反應生成的SO2氣體通入裝有20 mL水的三角瓶中，待檢測到水溶液呈酸性（pH=1）時加入斷馬錢子酸固體粉末20 mg，磁力攪拌器不斷攪拌，使之混合均勻，密封保溫放置15 h，回收溶劑至幹，甲醇複溶，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，產生了化合物2，3。
2.2.2 反應2 在斷馬錢子酸水溶液（1 g·L-1）中通入由Na2S2O3溶液（1 mol·L-1）與H2SO4（3 mol·L-1）水浴40 ℃生成的SO2氣體，每隔1 h取樣200 μL，按照2.1項下的HPLC條件進行檢測，反應底物斷馬錢子酸與產物的HPLC，兩者峰麵積隨時間的變化後斷馬錢子酸完全轉化成為化合物2。