HPLC測定不同采收期川芎藥材中5種藥效成分的含量
化學
作者：劉金亮 範巧佳 鄭順林 譚傑 周娟 袁繼超 楊世民 孔凡磊
[摘要]該文建立了HPLC同時測定川芎藥材中阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和槁本內酯含量的方法。用40%乙醇提取樣品中的藥效成分，采用Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，0～5 min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30 min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0）為流動相，流速l mL·min-1，檢測波長0～4.3 min，321 nm，4.31～30 min，275 nm，柱溫35 ℃，進樣體積10 μL，應用安捷倫1100係列液相色譜儀進行測定。5種藥效成分的分離效果良好，在相應的濃度範圍內與峰麵積有良好的線性關係，相關係數均大於0.99，加樣回收率（n=6）均在94.44%～103.1%。該方法應用於研究都江堰產區（海拔600 m左右）不同采收期對川芎阿魏酸和4種內酯類物質含量的影響，試驗在4月15日（栽後245 d）至5月30日（290 d）內設置了10個采收期，發現5種藥效成分的含量與采收期（栽後天數）均呈二次或三次函數關係，隨著采收期的推遲而先增後減，阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和槁本內酯的含量在栽後260 ～265 d（4月30日至5月5日）最高。
[關鍵詞]川芎；HPLC；采收期；含量
川芎Ligusticum chuanxiong Hort.為傘形科槁本屬多年生草本植物，以根莖入藥，味辛、性溫，具有活血行氣、祛風止痛等功效[1]。川芎的主要藥效成分包括阿魏酸、總生物堿、內酯類化合物、揮發油和酚性成分等物質[2-3]。
目前川芎的質量評價主要以《中國藥典》2010年版（一部）的質量規範為標準，對川芎性狀、阿魏酸的含量（≥0.1%）、水分（≤12%）、總灰分（≤6%）、酸不溶性灰分（≤2%）、浸出物（≥12%）做了相關規定[1]。僅以阿魏酸一種藥效成分來評價川芎品質的高低有失偏頗，作者一致認為加之其他藥效成分綜合評價更為合理。如今測定阿魏酸單一成分含量的方法較多[4-9]，也有單一測定槁本內酯的方法[10]，或阿魏酸與川芎嗪、阿魏酸與槁本內酯2種成分同時測定的方法[11-12]，還有一些有關成分測定和川芎指紋圖譜建立的方法[5-6，13-16]，總之，這些方法隻是單一成分及少數成分的定量測定，或是指紋圖譜中沒有確定具體成分、結構及藥效作用，隻是對所測的材料確定了共有峰的數量及相對麵積大小（不能代表藥材中的真實含量），且存在耗時較長和溶液消耗較多的缺點，均不利於對川芎藥材品質的綜合評價，需要建立一套能同時測定多種藥效成分的快捷、高效而可靠的分析方法，以便全麵、正確地綜合評價川芎藥材的品質。
另外，不同的采收期對川芎的品質影響較大，蔣桂華和饒凡[17-18]等對川芎的采收期有過研究，遺憾的是其涉及的采收期較少或隻測定阿魏酸、生物堿和揮發油3個指標的含量，不足以篩選川芎的最適采收期；近年來，隨著種植結構和耕作製度的改變，川芎的收獲期逐漸提前，位於四川彭山縣的川芎產區也是雜交水稻的製種區，為保證製種水稻提前栽秧，川芎的采收期提前到了4月上中旬；位於都江堰和彭州市的川芎主產區，主要實行的是川芎-水稻輪作製，為了提高水稻產量，所選用水稻品種的生育期呈延長之勢，也在一定程度上影響了川芎的適時收獲。因此，係統研究川芎采收期特別是早收對川芎品質的影響可為川芎的生產提供理論依據。
本文建立了HPLC同時測定川芎藥材中阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和槁本內酯含量的方法，為川芎藥材及相關產品的品質評價提供新的方法參考，同時研究川芎采收期對川芎品質的影響對川芎的優質高產栽培及川芎-水稻輪作製度有重要意義。
1材料
安捷倫1100 LC係列液相色譜儀，ChemStation 化學工作站、VWD檢測器；CAP 225D電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司），SB-5200 DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。
試驗材料培養於川芎藥材采收期試驗田，川芎苓種來自都江堰市三江鎮，2011年8月10日栽種在都江堰市石羊鎮廣益村試驗田，土地平整，地力均一，pH為5.83，堿解氮58.34 mg·kg-1，速效磷114.27 mg·kg-1，速效鉀42.31 mg·kg-1，有機質23.82 g·kg-1。試驗采用單因素隨機區組設計，設置10個采收期，分別為2012年4月15日（栽後245 d，下同）、2012年4月20日（250 d）、2012年4月25日（255 d）、2012年4月30日（260 d）、2012年5月5日（265 d）、2012年5月10日（270 d）、2012年5月15日（275 d）、2012年5月20日（280 d）、2012年5月25日（285 d）和2012年5月30日（290 d）。重複3次，共30個處理，試驗小區麵積為20 m2。施肥[19]、密度[20]及其他栽培管理措施保持小區間一致。
甲醇（HPLC級）和乙腈（HPLC級）購買於賽默飛世爾科技股份有限公司，乙醇（HPLC級）和冰乙酸（AC級）購買於成都科龍化工試劑廠，超純水由娃哈哈純淨水（杭州娃哈哈集團有限公司）代替，標準對照品阿魏酸和槁本內酯購買於中國食品藥品檢定研究院，洋川芎內酯I、洋川芎內酯H和洋川芎內酯A購於四川省中藥標準中心。
2方法與結果
2.1色譜條件
Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為0～5 min，乙腈-甲醇-1%冰醋酸（20∶40∶40），5～30 min，乙腈-甲醇-1%冰乙酸（60～100∶0∶40～0）；流速l mL·min-1；檢測波長0～4.3 min，321 nm，4.31～30 min，275 nm；柱溫35 ℃，進樣體積10 μL。
2.2對照品溶液的製備
分別準確稱取阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和槁本內酯等5種對照品32.000，50.000，50.000，50.000，100.000 mg，用甲醇定容到100 mL，搖勻，即得對照品儲備溶液。分別準確吸取一定量的上述儲備液於10 mL量瓶中，用40%乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得到0，3.2，6.4，12.8，19.2，25.6，32.0 ，64.0 mg·L-1的阿魏酸對照品溶液0，25，50，100，200，300，400，500 mg·L-1 3種洋川芎內酯（I，H和A）對照品溶液和0，0.050，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500，1.000 g·L-1的槁本內酯對照品溶液。
2.3供試品溶液的製備
2.3.1 回流提取法 取川芎樣品0.5 g，精密稱定，置於圓底燒瓶中，精密加入40%乙醇50 mL，稱重，加熱回流提取30 min，放冷，再稱定質量，用40%乙醇補足失重，搖勻，靜置，取上清液，濾過，續取濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過，注入高效液相色譜儀。
2.3.2 超聲提取法 取川芎樣品0.5 g，精密稱定，置於圓底燒瓶中，精密加入40%乙醇50 mL，稱重，超聲提取30 min（200 W，40 ℃），放冷，再稱定質量，用40%乙醇補足失重，搖勻，靜置，取上清液，濾過，續取濾液，0.45 μm微孔濾膜濾過，注入高效液相色譜儀。
結果表明加熱回流法與超聲波法對提取川芎藥材中的阿魏酸和洋川芎內酯H的含量差異顯著，超聲法提取效果更佳，其餘3種內酯類物質的含量差異不顯著，由於超聲波法對藥效成分的提取操作更加簡便，且效率更高，在工作過程中放出的熱量更少，故本文選用超聲波優化提取法[21]作為提取川芎藥材中上述5 種主要藥效成分的方法。
2.4方法學考察
2.4.1 線性關係 精密吸取2.2項下稀釋的對照品標準溶液10 μL注入液相色譜儀，平行測定3次，取平均峰麵積。以進樣量（X，μg）為橫坐標，峰麵積（Y）為縱坐標繪製標準曲線並進行回歸計算，得到阿魏酸、洋川芎內酯I、洋川芎內酯H、洋川芎內酯A和槁本內酯的回歸方程分別為Y=73.630X+1.888 （R2=1.000），Y=33.922X-4.682 （R2=0.999），Y=6.117X-3.739 （R2=0.999），Y=4.664X+0.493 （R2=0.999） 和Y=9469.800X +4.622（R2=0.999），分別在0.049～ 64，0.785～500，2.334～500，0.188～500，0.025～1 000 mg·L-1線性關係良好。