2.5統計處理方法 各項數據均重複3次後計算結果，實驗數據用±s表示，實驗組與對照組之間采用t檢驗，使用統計軟件Graph Pad Prism 5進行統計。P-1呈現明顯的量效和時效賴關係。
3.2Hochest 33258熒光染色 不同濃度新藤黃酸處理B16細胞24 h，Hoechst 33258染色，熒光顯微鏡下觀察發現：未經新藤黃酸處理的細胞其細胞核內無致密濃染現象，呈現均一黯淡的藍色熒光；新藤黃酸處理後的細胞中，多數細胞核呈現藍白色、碎塊狀致密濃染，少數細胞整個細胞核表現為藍白色致密濃染，呈現明顯的凋亡特征，且隨著新藤黃酸濃度的增加出現藍色致密濃染的細胞比例隨之增加。
3.3透射電鏡觀察B16細胞超微結構 電鏡下可見細胞出現胞體皺縮變圓，胞質凝縮，細胞質固縮，細胞核發生典型核染色質固縮、邊集、核碎裂成碎片等現象，其中可以觀察到與對照組相比新藤黃酸對線粒體的損傷，包括線粒體膜的破裂、腫脹，而對照組細胞線粒體形態正常，核膜完整，脊清晰、排列整齊。這些結果顯示，新藤黃酸能誘導B16細胞凋亡。
3.4新藤黃酸影響B16細胞內蛋白的表達變化 3.0 μmol·L-1 GNA作用B16細胞後隨著作用時間的延長，p-PI3K蛋白表達呈時間依賴性下降；而PI3K蛋白的表達量基本不變。為進一步研究新藤黃酸誘導B16細胞凋亡的分子機製，檢測了Akt，p-Akt蛋白的表達情況。實驗結果顯示，3.0 μmol·L-1 GNA作用B16細胞後隨著作用時間的延長，p-Akt蛋白表達呈時間依賴性下降；而Akt蛋白表達量基本不變。3.0 μmol·L-1 GNA分別作用B16細胞6，12，18，24 h後，p-mTOR蛋白的表達隨著時間的延長有所下降。3.0 μmol·L-1 GNA分別作用B16細胞6，12，18 ，24 h後，細胞內PTEN蛋白的表達呈時間依賴性增加。
4討論
PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路是由PI3K，Akt，mTOR 3種蛋白酶構成，PI3K/Akt/mTOR信號傳導通路的活化可以抑製多種刺激誘發的細胞凋亡，促進細胞周期進程，從而促進腫瘤細胞的生存和增殖，同時參與血管形成，在惡性腫瘤的發生、發展和耐藥方麵發揮重要作用，並參與腫瘤的侵襲和轉移[6-8]。
PTEN是繼p53基因後另一個較為廣泛地與腫瘤發生關係密切的抑癌基因。PTEN在細胞周期調控及細胞快速生長抑製中起著重要的作用。大量的研究發現在多種類型的癌症中存在PTEN基因突變或缺失。PTEN蛋白的異常表達與癌細胞的生長、凋亡、黏附、遷移浸潤等過程密切相關。已有研究證實PTEN是拮抗PI3K/Akt/mTOR信號的必要條件，PTEN通過將細胞膜上的PIP3去磷酸化生成PIP2，進而拮抗PI3K介導的細胞生長、代謝、增殖和存活信號[9]。目前，通過基因幹預方法敲除或小分子藥物抑製 PI3K，Akt 及相關基因，阻斷其對下遊多種抗凋亡效應分子的活化，促進細胞凋亡已經成為腫瘤治療研究的焦點[10]。
本實驗研究發現，新藤黃酸作用B16細胞後，透射電鏡和倒置熒光顯微鏡下與對照組相比，出現明顯的凋亡現象。為探討新藤黃酸誘導B16細胞凋亡的深入機製，檢測了相關蛋白的表達變化，結果可見：與對照組相比，隨著新藤黃酸給藥時間的延長，PTEN蛋白的表達呈現上調趨勢，而隨著PTEN蛋白的激活，其下遊的p-PI3K蛋白p-Akt蛋白以及p-mTOR蛋白的表達均呈現下調趨勢，而PI3K，AKT蛋白表達變化不明顯，這些結果提示新藤黃酸能夠在一定時間的範圍內抑製黑色素瘤B16細胞中PI3K/Akt/mTOR這一信號傳導通路的過度活化，誘導B16細胞凋亡。
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