新藤黃酸通過調控PI3K/Akt/mTOR 信號通路誘導黑色素瘤B16細胞凋亡的研究
藥理
作者：程卉 張璿 蘇婧婧 李慶林
[摘要] 目的：探討新藤黃酸誘導黑色素瘤B16細胞凋亡的機製。方法：MTT 試驗檢測新藤黃酸對B16細胞增殖抑製的作用；采用Hochest 33258熒光染色觀察新藤黃酸對B16細胞的影響；透射電鏡觀察新藤黃酸對B16細胞的超微結構的改變；Western blot法檢測PI3K，p-PI3K，Akt，p-Akt，p-mTOR，PTEN蛋白的變化以探討新藤黃酸誘導B16細胞凋亡的分子機製。結果：新藤黃酸對黑色素瘤細胞B16生長和增殖有明顯地抑製作用，並隨著新藤黃酸濃度的增加和作用時間的延長細胞活力明顯下降；Hochest 33258染色結果顯示，新藤黃酸處理的細胞中呈現明顯的凋亡特征；透射電鏡觀察發現新藤黃酸作用B16細胞後，細胞發生明顯凋亡的形態學變化；Western blot 檢測表明p-PI3K蛋白表達呈時間依賴性下降；p-Akt蛋白表達呈時間依賴性下降，而PI3K，Akt蛋白表達量基本不變，p-mTOR蛋白的表達隨著時間的延長有所下降，PTEN 蛋白的表達呈時間依賴性增加。結論：新藤黃酸在一定的時間和濃度範圍內能夠抑製黑色素瘤B16細胞的增殖，誘導細胞凋亡，其誘導細胞凋亡的機製可能與調控PI3K/Akt/mTOR信號通路有關。
[關鍵詞]新藤黃酸；細胞凋亡；B16；分子機製
黑色素瘤又稱惡性黑色素瘤，是由異常黑素細胞的過度增生所引發的一種常見的皮膚腫瘤。中國雖屬黑色素瘤的低發區，但近年來，惡性黑色素瘤發病的增長率呈逐年上升的趨勢，它轉移早、進展快、預後差、死亡率高，現今仍未發現治療黑色素瘤較好的藥物[1]。隨著中藥成分抗腫瘤的不斷研究發展，部分中藥活性成分已在臨床抗腫瘤實踐中取得令人滿意的療效，這也為黑色素瘤的治療藥物研發指明了方向。
藤黃係藤黃科植物所分泌的幹燥樹脂，據古代醫書記載，藤黃味酸澀、有毒，具有攻毒蝕瘡、破血散結等功效。主治癰疽、腫毒、頑癬、惡瘡、跌打損傷、創傷出血及燙傷。現代中醫臨床也廣泛用於治療癌症、瘡瘍、毛囊炎等[2]。新藤黃酸（GNA）是藤黃中主要成分之一，近年來研究表明，新藤黃酸具有良好的抗腫瘤活性[3-5]，抗癌譜廣。且藤黃作為治療皮膚疾患的中藥使用由來已久，本研究在前期工作的基礎上擬以小鼠皮膚黑色素瘤B16細胞作為研究對象，探討新藤黃酸對B16細胞誘導凋亡的可能機製。
1材料
1.1細胞株 黑色素瘤B16細胞來源於ATCC（美國國立細胞庫），中國科學技術大學生命科學院惠贈。細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中於37 ℃，5% CO2條件下培養，選取對數生長期細胞進行實驗。
1.2材料 DMEM（Gibco公司）；胎牛血清（Thermo Fisher scientific公司）；胰蛋白酶（Amersco公司）； Akt，β-actin，PI3K，p-PI3K購自Cruz Biotechnology （Santa Cruz，CA，USA）；Phospho-Akt（Ser 473），PTEN和p-mTOR購自Cell Signaling（Cell Signaling Technology， MA， USA）；ECL發光試劑盒（Thermo公司）。
1.3儀器 超淨工作台（蘇淨集團安泰公司）；Spectra Max M5多功能酶標儀（美國MD公司）；Hitachi-600透射電子顯微鏡（日本日立）；DMI-6000B倒置熒光顯微鏡（德國徠卡）。
2方法
2.1MTT試驗 取對數生長期的小鼠黑色素瘤B16細胞，消化收集細胞並將細胞調整為6×104個/mL的懸液，再接種於無菌的96孔板中，每孔100 μL，實驗設6個複孔，並設空白對照組。接種，培養過夜，鏡下觀察確認細胞貼壁良好。實驗組加入不同濃度的新藤黃酸溶液（0，0.75，1.5，3.0，6.0，12 μmol·L-1），細胞在培養箱中分別培養24，48，72 h。結束培養前4 h小心吸去細胞培養液，每孔加入MTT 溶液20 μL，37 ℃繼續培養4 h，每孔再加入DMSO 150 μL，振蕩20 min，混勻。570 nm波長酶標儀檢測每孔吸光度A，實驗重複3次。按照公式計算抑製率（IR）= （A陰性對照-A實驗組） /A陰性對照×100%。
2.2Hochest 33258熒光染色 將處於對數生長期的B16細胞以8×104個/孔接種到6孔板中，每孔分別加入2 mL細胞培養基。於種板後24 h，吸棄各孔中的培養液，新藤黃酸處理組各孔中分別加入含新藤黃酸1.5，3.0，6.0 μmol·L-1的培養基3 mL，對照組加入完全培養基3 mL。置37 ℃恒溫培養箱中孵育24 h後，棄各孔中培養基，PBS（pH 7.4）衝洗細胞，共2次，每次5 min；加入1～2 mL 2%多聚甲醛固定10 min，棄多聚甲醛，PBS緩衝液漂洗細胞3次，每次5 min。再加入l0 g·L-1 Hoechst 33258在37 ℃下避光孵育l h，最後PBS緩衝液輕洗細胞，5 min 1次，倒置熒光顯微鏡下觀察並拍照。
2.3透射電子顯微鏡觀察黑色素瘤B16細胞超微結構 B16細胞接種於6孔板，過夜後再加1.5，3.0，6.0 μmol·L-1新藤黃酸處理24 h，空白對照組加完全培養基繼續培養。胰酶消化後離心收集細胞，預冷的PBS洗2遍，細胞團塊用2.5%戊二醛4 ℃固定12 h以上，製備超薄切片，枸櫞酸鉛染色，透射電鏡下觀察並攝片。
2.4Western blot檢測蛋白變化 B16細胞在3.0 μmol·L-1新藤黃酸作用6，12，18，24 h後提取細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。10%～15%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，然後將蛋白轉移至硝酸纖維素膜。以5%脫脂奶粉封閉，4 ℃ 一抗孵育過夜。PBST 洗滌3次，每次10 min。再加HRP標記的二抗稀釋液室溫孵育2 h，PBST 洗滌3 次，每次10 min。ECL試劑盒顯影，Bio-Rad 凝膠成像係統采集圖片。