蓽茇總生物堿對6—羥基多巴胺致帕金森病大鼠多巴胺能神經元損傷的保護作用研究
藥理
作者：鄭麗 王浩 巴寅穎 劉浩龍 王萌 郭未蔚 吳霞 楊慧
[摘要] 目的：探討蓽茇總生物堿（PLA）對6-羥基多巴胺（6-OHDA）致帕金森病（PD）大鼠多巴胺能神經元損傷的保護作用及其可能的機製。方法：采用腦立體定位單側紋狀體注射6-OHDA建立大鼠PD模型，將PD大鼠隨機分為PLA組（PLA 50 mg·kg-1·d-1），美多巴組（美多巴50 mg·kg-1·d-1）及模型組，每組15隻，每日灌胃給藥1次，連續6周。另隨機選取15隻大鼠在紋狀體僅注射生理鹽水作為假手術組。采用阿樸嗎啡（APO）誘導的大鼠旋轉及轉棒實驗進行行為學觀察，酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化檢測大鼠黑質中TH陽性細胞數及紋狀體中TH陽性纖維密度，用分光光度法檢測大鼠黑質及紋狀體內超氧化物歧化酶（SOD）、穀胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、還原型穀胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）及一氧化氮合酶（NOS）的含量。結果：帕金森病大鼠在APO誘導後出現明顯的旋轉行為，且在轉棒上的滯留時間縮短，黑質區TH陽性細胞數及紋狀體TH陽性纖維密度明顯減少，組織內SOD，GSH-Px，CAT的活力降低，NOS的活力升高，MDA，NO含量升高，GSH含量降低，總抗氧化能力明顯降低。PLA能明顯改善PD大鼠的行為學異常，增加黑質區TH陽性細胞數及紋狀體TH陽性纖維密度，提高組織內SOD，GSH-Px，CAT的活力，降低NOS的活力，降低MDA和NO含量，提高GSH含量，總抗氧化能力明顯提高。結論：蓽茇總生物堿對6-OHDA致PD模型大鼠的黑質細胞具有保護作用，其機製可能與抗氧化活性有關。
[關鍵詞]帕金森病； 蓽茇； 生物堿； 6-羥基多巴胺； 抗氧化
帕金森病（Parkinson′s disease，PD）是一種神經係統退行性疾病，其病理特征為黑質和紋狀體多巴胺（dopamine，DA）能神經元變性缺失、紋狀體DA 含量顯著減少[1]。目前臨床上常用左旋多巴類藥物治療PD，該類藥物隻能改善PD的臨床症狀，無法從根本上控製和阻斷PD的進程。並且隨著病程不斷增長和用藥量的加大，所顯現出來的副作用也越來越明顯。因此，尋找療效確切且副作用小的藥物成為研究PD藥物的熱點。
蓽茇Piper longum L.是中蒙藏維醫習用藥材，具有溫中散寒，行氣止痛等功效，在印度也廣泛應用[2]。蓽茇中含有較豐富的酰胺類生物堿，並且具有抗炎、抗氧化、抗乙肝病毒和免疫調節等廣泛的藥理活性[3-4]。近年來的研究表明，蓽茇中含量最高的胡椒堿具有很強的抗氧化作用，可以通過抑製線粒體膜通透性的改變減少MPP+誘導PC12細胞的凋亡[5]，並且對6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導的PD大鼠具有神經保護作用，推測可能是通過抗凋亡和抗炎機製發揮神經保護作用[6]。本課題組在前期研究工作中，已建立了蓽茇總生物堿（PLA）有效部位提取製備的穩定工藝[7]，並對蓽茇總生物堿的化學成分及其在大鼠體內的藥代動力學和組織分布進行了研究[8-10]，為蓽茇總生物堿的藥效研究奠定了基礎。本研究以6-OHDA單側損傷紋狀體製備PD大鼠模型，探討蓽茇總生物堿對損傷神經元的保護作用及其對氧化應激反應的影響，為開發蓽茇防治帕金森病提供初步的實驗依據。
1材料與方法
1.1試劑 6-羥基多巴胺（6-OHDA，美國Sigma公司，批號MKBH3054）；阿樸嗎啡（apomorphine，APO，美國Sigma公司，批號 SLBB0077V）；美多巴（上海羅氏有限公司，批號SH1001）；酪氨酸羥化酶單克隆抗體（美國Sigma公司，批號101M4796）；鼠ABC檢測試劑盒（美國Vector公司，批號172013）；濃縮型DAB試劑盒（北京中衫金橋生物技術有限公司，批號K133319D）；總蛋白定量測試盒（批號 20130216），超氧化物歧化酶（SOD）測試盒（批號 20130614），丙二醛（MDA）測試盒（批號 20121120），還原型穀胱甘肽（GSH）測試盒（批號 20130228），穀胱甘肽-過氧化物酶（GSH-Px）測試盒（批號 20121122），一氧化氮（NO）測試盒（批號 20130426），一氧化氮合酶（NOS）測試盒（批號20130223）均購自南京建成生物工程研究所。
1.2儀器 Stoelting腦立體定位儀（美國Stoelting公司）；大鼠旋轉行為記錄儀（美國Columbus Instruments公司）；大鼠疲勞轉棒儀（西班牙Panlab公司）； CM 3050S冰凍切片機（德國Leica公司）；ECLIPSE80i型顯微鏡（日本Nikon公司）； SIGMA-3K15冷凍離心機（德國SIGMA公司）；SPECTRA max PLUS384連續光譜酶標儀（美國分子儀器公司）。
1.3蓽茇總生物堿的製備 蓽茇藥材購於新疆維吾爾醫院藥房（批號PLL-10-09），由新疆藥物研究所劉慶華研究員鑒定為胡椒科胡椒屬植物蓽茇P. longum的未成熟的果穗。稱取幹燥粉碎的蓽茇果穗3 kg，加入85%乙醇15 L加熱回流提取，提取液過濾後合並濾液，回收乙醇得到蓽茇提取物。蓽茇提取物溶於水後經大孔樹脂采用0%，20%，40%，60%，85%的乙醇水溶液梯度洗脫，將60%乙醇洗脫流分合並後回收乙醇，減壓幹燥得到蓽茇總生物堿有效部位，紫外分光光度法測定其總生物堿質量分數為64.43%。HPLC檢測其胡椒堿、蓽茇明寧堿和二氫蓽茇明寧堿質量分數分別為50.68%，3.74%，0.62%。
1.4動物分組及處理 雄性SD大鼠120隻，SPF級，體重220～240 g，購於北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）2012-0001。實驗前適應性飼養7 d。造模成功後隨機分為模型組、假手術組、PLA組、美多巴組，每組15隻。模型篩選24 h後開始灌胃給藥，PLA組給予蓽茇總生物堿50 mg·kg-1·d-1，美多巴組給予美多巴50 mg·kg-1·d-1，模型組、假手術組給予相同劑量的0.5% CMC-Na水溶液，連續給藥6 周，每日1次。
1.5PD大鼠模型的製作及篩選 大鼠經10%水合氯醛（3.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉後，顱平位固定於大鼠腦立體定位儀上，頭部備皮消毒後，切開頭部皮膚，充分暴露前囟。參照Paxinos等[11]的大鼠腦立體定位圖譜，確定左側紋狀體三坐標點[12]：一點為前囟前0.7 mm，矢狀線左側旁開2.6 mm，硬膜下6.0 mm；一點為前囟前0.7 mm，矢狀線左側旁開2.6 mm，硬膜下5.5 mm；另一點為前囟前0.7 mm，矢狀線左側旁開2.6 mm，硬膜下5.0 mm處。每點用微量注射器緩慢勻速（1.0 μL·min-1）注入6-OHDA（4 g·L-1，用含0.02%抗壞血酸的生理鹽水配製）1.0 μL，注射完畢後留針5 min，然後緩慢退針，縫合切口皮膚，外塗青黴素粉劑預防感染。假手術組用上述相同方法向左側紋狀體注射同體積的含0.02%抗壞血酸的生理鹽水。術後第5周，以皮下注射0.5 mg·kg-1APO誘發大鼠向健側旋轉[13]，先使大鼠適應測試環境5 min，再用計算機自動測試係統記錄APO所誘發的大鼠旋轉行為，記錄開始旋轉至30 min內的旋轉圈數，以向左側（損傷側）旋轉圈數與向右側（健側）旋轉圈數的差值在30 min內的平均數為淨旋轉圈數，且淨旋轉圈數>80 r·h-1，則視為成功模型。
1.6行為學檢測 分別於大鼠給藥後第3周和第6周以皮下注射APO 0.5 mg·kg-1誘發各組大鼠向健側旋轉，記錄開始旋轉至30 min內的旋轉圈數。分別於給藥後第3，6周進行大鼠轉棒行為觀察。測試前1周每天將大鼠在8 r·min-1的轉速下訓練3次，每次5 min，2次訓練之間間隔20 min作為疲勞恢複時間。測試當天，將大鼠放在轉棒上，啟動轉棒，開始計時，大鼠為保持平衡而跟隨轉棒運動，逐漸增加轉棒轉速，觀察大鼠運動，直至大鼠從轉棒上掉落，結束計時。
1.7TH免疫組化染色 各組大鼠麻醉後經心髒灌流固定，斷頭取腦，經冰凍切片，進行免疫組化染色（ABC法）。切片入0.3% Triton X-100透膜30 min；3% H2O2封閉內源性過氧化物酶；正常羊血清封閉30 min；TH一抗4 ℃孵育過夜；生物素標記羊抗小鼠二抗，室溫孵育2 h；辣根酶標記的鏈黴卵白素，室溫孵育30 min，37 ℃ 孵育30 min。以上各步驟均用 0.01 mol·L-1 PBS洗5 min×3。最後用DAB顯色。常規脫水、透明、封片。每隻大鼠各取紋狀體、黑質相同部位腦片3張，通過Nikon顯微鏡采集圖像，用NIS-Elements 病理圖像分析係統（Ver.2.1）進行分析，根據灰度值選取TH陽性細胞和TH陽性纖維，計算黑質區域TH陽性細胞數目和紋狀體區域TH陽性纖維密度值。
1.8腦組織各生化指標的測定 大鼠斷頭後迅速取腦組織，分離雙側紋狀體及中腦腹側組織，準確稱取質量，用0.9%的生理鹽水製成10%的組織勻漿，2 500 r·min-1離心取上清，分裝後置於-80 ℃ 凍存。采用生物化學法檢測 SOD，CAT，GSH-Px，NOS活性以及MDA，GSH，NO含量。以上測定均嚴格按照試劑盒說明書進行測定。