32D細胞依賴IL-3生長，加入 IL-3後，細胞快速增殖並聚集成簇，形成明顯的細胞團，該成簇生長的特征反映了32D細胞增殖的最佳狀態。通過32D細胞加入IL-3後成簇生長的特征，評價了DYS單獨促32D細胞增殖的能力。對照細胞在缺乏IL-3或DYS的條件下，細胞逐漸死亡，在培養第9天，僅有單個散在的活細胞存在，且數量非常有限；而加入 DYS的細胞明顯聚集成簇，與IL-3加入後形成的細胞團相同，但聚集成簇的細胞團略小於加入IL-3的細胞，此結果進一步證實了DYS的促造血生長作用。
3.3DYS對32D細胞分化的影響 為了證實DYS誘導巨核細胞分化的作用，在缺乏IL-3的培養條件下，采用20 mg·L-1的DYS單獨處理細胞，在第4天和第9天經Giemsa染色，結果顯示：與培養第4天的對照細胞相比，DYS單獨處理細胞後第4天，多倍體巨核細胞數量增加，且胞體變大；培養至第9天細胞大部分死亡，僅剩胞體變大的細胞。經Giemsa染色並記錄不同倍體巨核細胞的百分率，結果顯示：在缺乏IL-3的條件下培養9 d，2N細胞幾乎全部死亡，4～32N巨核細胞數明顯增加，DYS處理細胞中的4N細胞明顯減少，但8～32N細胞明顯增加，其中16N細胞增加尤其明顯，為對照細胞的2.3倍。此結果初步證實地榆具有促進巨核祖細胞成熟分化的作用。
3.4DYS對Baf3細胞mIL-3受體表達水平的影響 Baf3細胞表達mIL-3受體並依賴IL-3生長，DYS是否能上調mIL-3受體的表達，值得進一步研究。采用RT-PCR技術，研究了地榆總皂苷對IL-3受體mRNA表達水平的影響，結果顯示，DYS單獨處理Baf3細胞48 h後，IL-3受體mRNA水平明顯增加，但72 h後下降至對照水平。
3.5DYS對32D細胞c-kit表達水平的影響 c-kit為幹細胞因子受體，在巨核祖細胞向成熟分化過程中發揮了重要作用。因此，進一步檢測了DYS對32D細胞的c-kit表達的影響。與對照細胞比較，DYS單獨處理細胞後能明顯上調c-kit的表達，此結果提示地榆總皂苷也能通過上調巨核祖細胞c-kit表達而發揮促巨核細胞增殖和分化的作用。
4討論
前期研究發現地榆總皂苷能單獨或增強TPO刺激的Baf3/Mpl細胞增殖，且能顯著增加TPO受體表達水平。Baf3/Mpl細胞源自於Baf3細胞，前者通過轉入TPO受體Mpl後依賴TPO因子生長。本研究中，采用了無外源性Mpl表達並依賴IL-3生長的Baf3細胞以及依賴IL-3生長的32D細胞，評價了地榆總皂苷的促造血增殖作用。在缺乏IL-3的條件下，地榆總皂苷能明顯促進Baf3細胞和32D細胞增殖，表明DYS可不依賴TPO和IL-3而促進巨核祖細胞的增殖。此外，延長DYS處理32D細胞的時間，可明顯增加16～32N巨核細胞數量，證實DYS單獨處理細胞不僅可促其增殖，而且具有促其向巨核細胞成熟分化的作用。
早期認為，巨核細胞增殖以及分化成熟主要受巨核細胞祖細胞集落刺激因子（MK-CSF）和促血小板生成素（TPO）的雙水平調節。隨後對小鼠和人類巨核細胞的體外研究表明，巨核細胞生成受多種體液因子的多水平調節，包括IL-3，IL-6和EPO細胞因子。近來研究證實，在造血幹細胞和祖細胞中，幹細胞因子（SCF）及其受體c-kit對巨核細胞增殖、分化和產生血小板的影響較其他細胞更為顯著[3-4]。DYS促進巨核祖細胞增殖以及分化的作用可能與其他受體如IL-3受體和c-kit有關。據此，進一步在mRNA水平研究了DYS對2種受體表達的影響，結果發現DYS確能上調2種受體的表達。
IL-3受體屬於Ⅰ型造血細胞因子受體超家族[5]，由特異性α鏈和β鏈構成，其α鏈與IL-3結合形成低親和受體異二聚體，隨後與β鏈結合形成高親和受體複合物，導致β鏈的磷酸化並激活相應的信號轉導途徑[6-8]。IL-3受體主要在骨髓細胞中表達，與IL-3結合後可促進多種造血細胞增殖，包括中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、單核細胞、巨核細胞、紅細胞以及B細胞[9]。本研究發現DYS在無外源性IL-3的作用下可促進需依賴IL-3生長的2種巨核細胞增殖，同時上調細胞IL-3R的表達，這提示DYS可能具有擬IL-3的作用，包括促進巨核細胞等多種造血細胞的增殖及成熟。另有研究表明，IL-3不僅可直接作用於造血細胞，還可通過協同幹細胞因子（SCF）及其受體c-kit，經一係列反應激活下遊信號轉導通路，從而調節骨髓巨核細胞的增殖與分化。且多篇文獻報道，激活SCF-c-kit通路在抗腫瘤藥物損傷後的造血恢複過程中可表現出良好的血小板恢複作用[3-4]。由此推測DYS對IL-3R和c-kit表達水平的上調是其發揮促巨核祖細胞增殖和分化的重要機製之一。同時，結合前期研究結果，DYS可不依賴TPO或IL-3而促進Baf3/Mpl，Baf3，32D細胞生長，表明DYS具有明顯的多效細胞因子作用。
由於本研究中DYS為地榆總皂苷提取物，DYS中除含有地榆皂苷I單體成分外，尚含有多種其他成分，進一步區分DYS中皂苷及非皂苷類成分的作用，尤其研究不同單體成分對巨核祖細胞增殖及分化的作用將具有更為重要的價值和意義。
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