地榆總皂苷對巨核祖細胞增殖分化及相關受體表達的影響
藥理
作者：代燕平 高小平 吳建明 李翔 黃飛鴻 鄒文俊
[摘要] 目的：觀察地榆總皂苷（DYS）對Baf3細胞和32D細胞的促增殖和分化作用，以及對IL-3受體和幹細胞因子受體c-kit表達水平的影響。方法：培養依賴IL-3生長的Baf3細胞和32D細胞，在加或不加IL-3條件下，用質量濃度為5，10，20，30，40 mg·L-1的DYS分別處理細胞24，48，72，96 h後，采用CCK8方法檢測細胞增殖；並用Giemsa染色檢測細胞分化；另以RT-PCR方法檢測DYS對Baf3細胞IL-3受體及對32D細胞c-kit表達水平的影響。結果：DYS單獨處理細胞48 h，明顯促進Baf3細胞和32D細胞增殖；與對照細胞比較，DYS處理32D細胞呈現成簇生長並形成許多大的細胞團；在加入IL-3的條件下，DYS也能明顯增強IL-3的促細胞增殖作用。此外，DYS高濃度單獨處理32D細胞可明顯誘導多倍體巨核細胞數增加，促進巨核細胞分化。在mRNA水平，DYS單獨處理細胞也能明顯上調IL-3受體和c-kit的表達。結論：地榆總皂苷單獨作用能促使2種巨核祖細胞的增殖和分化，其作用與上調IL-3受體和c-kit表達水平有關。
[關鍵詞]地榆總皂苷；造血細胞增殖；巨核細胞分化；白細胞介素3；白細胞介素3受體；幹細胞因子受體
地榆總皂苷（DYS）促造血作用已從體內外研究中獲得證實[1]，作者前期的研究發現[2]，DYS可單獨或協同細胞因子促進造血細胞增殖，尤其，DYS單獨處理能顯著增加依賴促血小板生成素（TPO）生長的Baf3/Mpl細胞增殖，且在mRNA水平促進TPO受體（TPOR）的表達。Baf3/Mpl細胞源自於小鼠髓係巨核祖細胞係Baf3，後者依賴IL-3生長。通過轉入TPOR後，Baf3細胞也可依賴TPO生長，因此命名為Baf3/Mpl細胞。盡管已證實DYS單獨能促進Baf3/Mpl細胞增殖，且與上調TPO受體表達水平有關，但Baf3/Mpl細胞也表達IL-3受體，DYS的促增殖作用與IL-3受體是否也有關聯，尚值得進一步探索。本研究采用未經Mpl受體轉染的Baf3親本細胞在加入或缺乏IL-3的體外培養條件下，觀察地榆總皂苷對細胞生長的影響，同時研究了地榆總皂苷對IL-3受體表達的影響；另選擇了依賴IL-3生長的32D小鼠髓係祖細胞係，研究了地榆總皂苷的促增殖作用，並觀察了DYS誘導巨核細胞分化的作用以及對幹細胞因子受體c-kit表達的影響，為進一步探索促造血的多效性奠定基礎。
1材料
1.1地榆總皂苷製備 取幹燥地榆（購自成都市五塊石藥材市場，並由成都中醫藥大學賈敏如教授鑒定為地榆Sanguisorba officinalis L.）粉碎成粗粉，稱取500 g並加入10倍量95%乙醇浸泡30 min，回流提取3次，每次60 min，尼龍布過濾；合並提取液，減壓過濾得透明微紅色液體，減壓回收乙醇，加水混懸，保溫至60 ℃，乙酸乙酯趁熱萃取，連續3次，合並乙酸乙酯萃取液，回收乙酸乙酯，即得地榆總皂苷粗提物。HPLC測定地榆皂苷I質量分數大於70%。使用前用DMSO溶解，無菌PBS稀釋至1 g·L-1，待用。
1.2試劑與儀器 RPMI 1640培養基（Gibco）；新生胎牛血清（HyClone）；重組小鼠白介素3（mIL-3，Sigma公司）；一步法RT-PCR試劑盒（Takara）；二氧化碳培養箱（Sanyo公司）；普通光學顯微鏡和倒置相差顯微鏡（Olympus公司）；多功能酶標儀（Perkin Elmer公司）。
2方法
2.1細胞及細胞培養 依賴IL-3生長的Baf3細胞和32D細胞係均購買自ATCC。細胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養，IL-3（2 μg·L-1）參照說明補充加入培養體係中。
2.2細胞增殖測定 Baf3和32D細胞維持培養在對數生長期，用無血清培養基洗滌3次，懸浮於含0.5%胎牛血清的無細胞因子培養基中，次日以適量細胞數分別接種於96孔培養板內，分別設置空白對照組、地榆總皂苷單獨處理組、IL-3單獨處理組、地榆總皂苷+IL-3處理組。用無IL-3、無血清培養基稀釋地榆總皂苷溶液，按照設置濃度加入細胞，使其終質量濃度分別為5，10，20，30，40 mg·L-1，IL-3濃度參照細胞維持生長所需濃度加入。細胞在37 ℃條件下連續培養至指定時間，采用CCK8試劑盒並參照說明書提供的方法進行細胞增殖檢測。
2.3Giemsa染色和巨核細胞計數 Baf3和32D細胞分別接種於6孔板中，采用較高質量濃度（40 mg·L-1）的DYS分別處理2種細胞，Baf3細胞在DYS處理120 h後塗片用甲醇固定5 min，Giemsa染色10 min，染色後的標本用緩衝液洗滌，晾幹，顯微鏡觀察其形態學變化；32D細胞在DYS處理9 d後光學顯微鏡下以細胞核內分裂分類計數100個細胞中的多倍體巨核細胞數，分類以雙核為4N，4核為8N，依此類推。
2.4RT-PCR檢測 Baf3細胞和32D細胞分別接種在6孔培養板，加入地榆總皂苷溶液（10 mg·L-1），37 ℃條件下繼續培養，分別於24，48，72 h收獲細胞，用Trizol試劑提取總RNA。參照RT-PCR試劑盒擴增細胞內目的基因，各基因引物均由作者設計，上海基康生物技術有限公司合成，引物序列及產物片段大小。IL-3R與c-kit擴增條件均為逆轉錄（RT）：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；PCR擴增條件：94 ℃ 15 s，48 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，24～26個循環；最後延伸72 ℃ 10 min，4 ℃ 1 h。同時設置內參基因GAPDH的擴增，循環數為24，其餘同目的基因擴增。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察並拍照，同時采用半定量方法（目的基因/GAPDH）計算目的基因表達水平。
2.5統計學方法 數據分析采用SPSS 17.0統計軟件包處理，實驗數據均以±s表示，組間均數比較采用單因素方差分析。
3結果
3.1DYS對Baf3細胞增殖的影響 Baf3細胞在缺乏IL-3培養條件時，細胞增殖明顯受抑製，但在含IL-3的培養條件下，Baf3細胞增殖明顯，證實Baf3細胞依賴IL-3生長；在不含IL-3的培養條件下加入DYS（10 mg·L-1）後，Baf3細胞數量也明顯增加，並呈時間依賴；在含IL-3的培養條件下加入DYS（10 mg·L-1），Baf3細胞數量增加更為明顯，並優於IL-3單獨刺激的細胞增殖結果。為了證實DYS的濃度依賴關係，進一步的研究結果顯示：在不加IL-3的條件下，DYS促進細胞增殖的作用僅在20 mg·L-1範圍內，超過此濃度範圍，細胞增殖減弱並呈現抑製細胞增殖的作用，但觀察到細胞胞體變大的現象。
3.2DYS對32D細胞增殖的影響 另采用依賴IL-3生長的32D細胞，證實了DYS促細胞增殖的作用。32D細胞在缺乏IL-3培養條件時，細胞增殖明顯受抑製，但在含IL-3的培養條件下，32D細胞增殖明顯，證實32D細胞依賴IL-3生長；在不含IL-3的培養條件下加入DYS（10 mg·L-1）後，32D細胞數量明顯增加，並呈時間依賴，此結果與在Baf3細胞中觀察到的結果一致。