北五味子總木脂素對腦缺血模型大鼠神經細胞凋亡及p—AKT表達的影響
藥理
作者：薑恩平 王帥群 王卓 於春榮 陳建光 於春豔
[摘要] 目的：觀察北五味子總木脂素（Schisandra chinensis lignans，SCL）對局灶性腦缺血損傷大鼠神經細胞凋亡和PI3K/AKT信號傳導途徑的影響，並探討其作用機製。方法：用北五味子總木脂素高、中、低劑量組（100，50，25 mg·kg-1）給大鼠分別灌胃給藥，連續14 d後，線栓法建立腦缺血損傷模型，進行神經功能評分，TTC染色觀察大鼠的腦梗死麵積，HE染色觀察腦組織的病理形態學改變，免疫組化檢測腦組織中Bcl-2和Bax的表達，Western blotting檢測腦組織內p-AKT和AKT蛋白的表達情況。結果：與模型組比較，北五味子總木脂素高、中、低劑量組均能不同程度縮小腦梗死麵積；改善腦組織的病理形態學改變；促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑製促凋亡蛋白Bax表達，同時促進p-AKT的表達。結論：北五味子總木脂素對大鼠腦缺血性損傷具有一定的保護作用，機製可能與其促進p-AKT活性增加，提高腦組織抗缺血損傷的能力和抑製神經細胞的凋亡有關。
[關鍵詞]五味子；腦缺血；磷脂酰肌醇3激酶；凋亡
缺血性腦血管疾病是臨床上的常見病和多發病，嚴重威脅著人類的健康。腦缺血後機體產生大量的自由基，毒性氨基酸等使凋亡相關基因激活，啟動凋亡信號通路，促進神經細胞出現凋亡和壞死。研究表明，PI3K （phosphatidylinositol 3-kinase，磷脂酰肌醇3激酶） /AKT（serine-threonine kinase，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）信號通路參與了凋亡過程並且與腦缺血損傷密切相關[1-2]。五味子Schisandra chinensis （Turcz.）Baill.是我國傳統中藥材，具有斂肺，滋腎，生津，收汗，澀精等作用。具有抗氧自由基，增強機體免疫力，抗腫瘤等藥理作用。此外五味子還具有改善心肌，促進微循環，減輕腦水腫等功能[3-6]。五味子的主要活性成分是木脂素，關於北五味子總木脂素（S.chinensis lignans，SCL）對腦缺血損傷的保護作用及機製目前尚不明確。本研究通過建立局灶性腦缺血損傷大鼠模型，觀察北五味子總木脂素對大鼠腦缺血性損傷的保護作用及對PI3K/AKT信號通路的影響，探討北五味子總木脂素保護腦缺血的機製。
1材料
1.1藥品與試劑 SCL由北華大學林學院食品科學與工程實驗室提供；紅四氮唑（TTC，上海市先進農場試劑廠）；免疫組化試劑盒（南京建成生物技術有限公司）；Bcl-2，Bax，p-AKT和AKT抗體（Sigma公司）；MCAO栓線（北京沙東生物技術有限公司）。
1.2動物 健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，合格證號0022216，清潔級動物室飼養，飲水不限，定時喂食。
1.3儀器 GIS-2008天能凝膠成像分析儀（上海天能科技有限公司）；立式電泳儀（江蘇海門市麒麟醫用儀器廠）；病理圖像分析係統（美國 Media Cybernetics公司）。
2方法
2.1北五味子總木脂素的製備過程 北五味子木脂素由北華大學林學院食品科學與工程實驗室優選北五味子新品種，采用超臨界CO2流體萃取，模仿口服藥物在胃腸道的轉運過程，選用特定pH依次連續提取（半仿生法提取）；經分子蒸餾，其蒸餾溫度110 ℃，進料速率65 L·h-1，真空度0.7 Pa；再通過AB-8大孔樹脂處理，總木脂素流量1.52 g·L-1，洗脫速度1 mL·min-1，乙醇95%、洗脫率78.9%；采用矽膠柱色譜法，200～300目矽膠，以石油醚-乙酸乙酯60∶1洗脫，得木脂素組分，采用紫外分光光度法，在570 nm檢測總木脂素，其純度為93.5%。
2.2模型製備 雄性健康SD大鼠，末次給予藥物2 h後用10%水合氯醛進行左下方腹腔注射麻醉，10 min進入麻醉維持期，將其仰臥位於鼠台上固定，頸部正中線縱向切口，先分離右側頸總動脈（CCA），後分離頸外動脈（ECA）和其下方的頸內動脈（ICA）。在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾於CCA近心端夾住，用手術線於遠心端打一活結，用圓頭帶有標記點的MCAO栓線通過事先用眼科剪在CCA上剪的切口進入向ICA緩緩推入約18 mm（從ICA和ECA分叉處算起），感到有輕微阻力且標記點在動脈分叉處左右停止，此時說明栓線已到達大腦前動脈。用手術線結紮固定栓線，縫合皮膚。假手術組隻分離出頸外動脈以及頸內動脈，其他步驟同上但不進行栓塞。待大鼠清醒後，觀察大鼠的體征，對大鼠進行神經症狀評分[7]，行為學評分≥2分的大鼠，表明模型的製作成功。24 h後立即斷頭取血取腦，同時進行病理組織學、免疫組化和Western blotting檢測。
2.3分組與給藥 50隻健康SD大鼠，隨機分成5組（按體重），每組10隻（至少保證模型建立成功8隻）。按常規進行飼養，進行不同的處理方法，每天上午灌胃1次，持續14 d後，末次給藥2 h後進行腦缺血動物模型的建立。具體分組及處理措施如下，假手術組：分離頸總動脈，不栓線，每天給予生理鹽水（10 mg·kg-1）灌胃；模型組：MCAO栓線，缺血，每天給予生理鹽水（10 mg·kg-1）灌胃；SCL高、中、低劑量組：造模手法同模型組，每天給予SCL（100，50，25 mg·kg-1）灌胃。
2.4大鼠腦梗死麵積測定 TTC（紅四氮唑）是呼吸鏈中吡啶-核苷結構酶係統的質子受體，為脂溶性光敏感複合物。實驗結束後立即對大鼠進行取腦，於-20 ℃冰箱放置2 min，目的為保持相對固定便於對腦組織行冠狀切片，將腦組織切成相對均勻的5片，避光於2%TTC磷酸鹽緩衝液（pH 7.4）37 ℃水浴中放置5～10 min，期間輕輕晃動使其與TTC接觸充分。TTC與正常組織中的脫氫酶反應而呈紅色，而缺血組織因脫氫酶活性下降，不能反應，故呈蒼白色，由此判定腦缺血麵積。應用BI2000軟件處理係統計算每個腦組織切片損傷麵積和總麵積，以5個腦組織切片中梗死麵積之和與5個腦組織切片麵積之和的比值反映梗死範圍。
2.5大鼠腦組織HE染色 實驗結束後，立即斷頭取腦，10%甲醛中固定，以由高至低梯度的乙醇進行洗脫，體積分數分別為70%，80%，90%，每種濃度乙醇中脫水1 h。100%乙醇中脫水2 h後在正丁醇中放置24 h。分別置於兩缸同濃度二甲苯中各5 min，浸蠟包埋後切片，於光學顯微鏡下進行觀察。正常腦組織神經元細胞排列整齊， 腦缺血大鼠神經元細胞排列紊亂，高倍鏡下，可見凋亡細胞，細胞核呈深藍色，形態各異，可見核固縮及碎裂，細胞漿淡染。