2.6免疫組化檢測腦組織中Bcl-2和Bax的表達 石蠟切片脫蠟水化後，按照免疫組化試劑盒操作：滴加試劑A 30 μL，室溫孵育20 min，PBS衝洗，進行抗原修複，滴加試劑B 30 μL，室溫孵育20 min，PBS衝洗，然後加一抗（兔抗大鼠Bcl-2和Bax多克隆抗體）濕盒4 ℃過夜；PBS衝洗後滴加試劑C 30 μL，室溫孵育30 min，PBS衝洗DAB顯色，自來水衝洗，蘇木素複染，氨水返藍，脫水透明後封片。顯微鏡下觀察，胞漿中有棕黃色顆粒者為陽性細胞。用Image-pro軟件分析計算各組陽性表達細胞的吸光度。
2.7Western blotting檢測腦組織內p-AKT和AKT蛋白的表達 腦缺血造模結束後立即斷頭取腦，置於液氮中保存。實驗時取腦組織200 mg用腦蛋白裂解液提取腦組織蛋白。用考馬斯亮藍進行蛋白定量。進行SDS-PAGE垂直板電泳，然後電轉至PVDF膜上，用脫脂奶粉封閉2 h；進行一抗孵育，用PBST洗膜，10 min×2次，將PVDF膜放入稀釋好的p-AKT和AKT（1∶1 000稀釋）中，4 ℃過夜；PBST洗膜後將PVDF膜放入辣根過氧化物酶標記的二抗中（1∶500），室溫孵育2 h；PBST洗膜後DAB顯色，凝膠成像係統拍照，計算機掃描並分析處理結果。
2.8統計學處理 本實驗中的所有數據統計學處理均以±s來表示，運用SPSS 11.0 統計軟件中的單因素方差分析（One-Way ANOVA）。其中關於組間比較選用t 檢驗對數據進行處理，P[8-13]。本實驗結果顯示，北五味子總木脂素各組對大鼠腦缺血性損傷具有一定的保護作用，減小腦梗死麵積，改善腦組織的病理形態學改變。提示北五味子總木脂素對腦缺血損傷具有一定的保護作用。同時免疫組化結果顯示北五味子總木脂素能夠促進抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑製促凋亡蛋白Bax的表達，提示其對腦缺血損傷的保護作用可能與抑製神經細胞的凋亡，影響凋亡信號通路有關。
PI3K/AKT信號轉導通路參與了腦缺血時神經細胞的凋亡。PI3K具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性。當腦缺血發生後，機體釋放的細胞生長因子，整合素等能夠激活具有酪氨酸激酶活性的受體，受體發生磷酸化並與PI3K的調節亞基結合使PI3K激活，促進位於PI3K下遊的效應分子AKT活化。AKT活化後能經多種途徑促進細胞存活。AKT既可以促進Bad，caspase-3等凋亡蛋白磷酸化，使其失活，也能夠促進抗凋亡基因如Bcl-2，Bcl-xL等基因的轉錄和表達，使細胞的存活[14-16]。本研究結果顯示，腦缺血時p-AKT表達減少，神經細胞凋亡數量增多；北五味子總木脂素各組均能夠使p-AKT表達增多，磷酸化的AKT促進下遊的抗凋亡蛋白的表達，使凋亡細胞減少，表明通過促進AKT活性增加可提高腦組織抗缺血損傷的能力及抗凋亡作用。北五味子總木脂素抗腦缺血的作用機製可能涉及到多環節、多層麵和多機製的，值得進一步深入研究。
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