雷公藤內酯醇對AA大鼠脊髓和背根神經節中iNOS，SP表達的影響
藥理
作者：陳偉 張旭東 逯卓卉 韋登明
[摘要] 目的：觀察不同劑量雷公藤內酯醇（triptolide，TP）對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis， AA）大鼠的鎮痛效應，及相應節段脊髓背角和背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、P物質（substance P，SP）表達的影響，探討TP對類風濕性關節炎（RA）鎮痛作用的可能機製。方法：選用SD大鼠50隻，隨機分成正常組（A組）、模型組（B組）、TP低（C組）、中（D組）、高（E組）劑量治療組。除A組外，每組大鼠右後足蹠皮內注入0.1 mL弗氏完全佐劑造模。造模後14 d，C，D，E組大鼠采取不同劑量（C組0.1 mg·kg-1，D組0.2 mg·kg-1，E組0.4 mg·kg-1）TP腹腔注射給藥，每天1次，連續給藥9 d之後檢測50%機械痛閾（mechanical withdraw threshold， MWT），用免疫組織化學方法檢測腰5（L5）脊髓背角和DRG節段中iNOS，SP的表達變化情況。結果：B組大鼠50%MWT顯著低於A組（P[1]。雷公藤製劑在臨床上治療RA具有確切的鎮痛療效，但其鎮痛的中樞神經生物學機製尚未明確。已有資料表明[2-3]，關節疼痛的發生與脊髓iNOS，SP的增加有關，抑製脊髓iNOS，SP的表達可以產生明顯鎮痛作用。而作為雷公藤製劑中藥理活性最強的雷公藤內酯醇（triptolide，TP）對佐劑性關節炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠鎮痛作用及其與脊髓iNOS，SP表達的關係研究尚未見報道。本實驗在建立AA大鼠模型基礎上，通過應用不同劑量TP治療AA大鼠，以機械痛閾、腰5（L5）節段脊髓和背根神經節（dorsal root ganglion，DRG）中iNOS，SP表達水平為觀察指標，旨在探討TP對AA脊髓和背根神經節（DRG）中iNOS，SP表達影響及其鎮痛作用的機製。
1材料與方法
1.1動物和藥品 SD大鼠50隻，雌雄各半，體重180～220 g，由寧波大學實驗動物中心提供，合格證號0102013。飼養環境安靜，室溫20 ℃左右，明暗各12 h，自由攝食，飲水。TP購於上海科衛醫療技術研究所產品（純度99.9%，批號20130111），將20 mg TP於4 mL 1，2-丙二醇中99 ℃水浴6 h溶解，加96 mL生理鹽水使TP終濃度為200 mg·L-1，同時製備4%丙二醇水溶液100 mL，過濾除菌分裝，4 ℃冰箱保存備用。
1.2試劑與儀器 弗氏完全佐劑（美國Sigma公司）；戊巴比妥鈉（德國Merck公司）；兔抗iNOS，SP多克隆抗體原液（博士德公司）；DAB顯色試劑盒（博士德公司）；SP免疫組化染色試劑盒（博奧森公司）。Ne12775-9von Frey絲（美國Stoelting公司）；HM-325石蠟切片機（德國LEICA公司）；BM-Ⅶ包埋機（宏業醫用儀器公司）；CX40生物顯微鏡（日本Olympus公司）。
1.3動物分組及AA大鼠模型製備 適應性喂養1周後，采用簡單隨機的方法將SD大鼠分成正常組（A組）、模型組（B組）、TP低劑量治療組（C組）、中劑量治療組（D組）、高劑量治療組（E組）。大鼠經戊巴比妥鈉麻醉後，A組於右後足蹠皮內注入0.1 mL生理鹽水作為對照，其餘各組大鼠在相同部位注入0.1 mL弗氏完全佐劑製備AA大鼠模型，待繼發關節炎出現，標誌造模成功，大約需要10～14 d。造模後第14天，A組和B組大鼠腹腔注射等體積4%丙二醇溶液，C，D，E組大鼠分別按0.1，0.2，0.4 mg·kg-1腹腔注射TP溶液，每日1次，連續9 d。
1.450%機械痛閾測定 測定50%機械痛閾（mechanical withdraw threshold，MWT）采用8根von Frey絲，分別為0.4，0.6，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，15.0 g。於造模前1 d，造模後14，23 d（TP治療9 d）將大鼠置於透明有機玻璃箱中，底部為金屬篩網。參照文獻使用的方法[4]，從2.0 g開始用von Frey絲垂直刺大鼠足底，直至其彎曲成S形，持續時間不超過8 s。若大鼠出現縮足反射，記為陽性反應，以“x”表示，並更換相鄰小一級von Frey絲再次測試；若無縮足發射，記為陰性反應，以“o”表示，並更換相鄰大一級von Frey絲再次測試，測試間隔時間10 s。如此可得到一個連續的以“o”或“x”組合的序列，以出現“x”的前一次的“o”作為起點，選擇包括該起點的6次連續刺激反應，作為推算50%MWT的序列。如果大鼠對2.0～15.0 g的刺激均為陰性時記為15 g，對2.0～0.4 g的刺激均為陽性時記為0.4 g。非上述2種情況50%MWT則根據下列公式推算：50%MWT（g）=（10[xf+Kδ]）/10 000，其中xf為序列中最後一根von Frey絲的對數值；K為根據測量所得“x”和“o”序列查表後得到的值；δ為各個纖毛力度取log後的均差，在此約等於0.224。
1.5免疫組織化學染色觀察各組大鼠脊髓和DRG中iNOS和SP的表達 造模後23 d，先測定各組大鼠的50%MWT，然後大鼠經左心室灌流固定，先以生理鹽水快速衝洗，直至由右心耳流出的液體清亮無色，然後用4 ℃預冷的4%多聚甲醛先快後慢灌流固定，灌注完畢後取L5節段脊髓和DRG，入固定液固定24 h後，L5節段脊髓和DRG經脫水，石蠟包埋、切片，按照試劑盒說明書進行iNOS，SP免疫組織化學染色。每隻動物隨機選取脊髓和DRG切片各3張，分別在100，400倍鏡下取6個視野進行圖像分析（JD801形態學圖像分析係統），測量陽性產物的積分吸光度（IA）。