牛樟芝對高脂血症大鼠主動脈內皮損傷相關基因表達的影響
藥理
作者：齊潔 陶雲 張鈞 傅建
[摘要] 目的：研究牛樟芝對高脂血症大鼠主動脈內皮損傷相關基因表達的影響。方法：SD大鼠50隻，隨機分為5組：正常對照組（N組）、模型組（M組）、牛樟芝低（AC-L）、中（AC-M）、高（AC-H）劑量組（250，500，1 000 mg·kg-1）。用高脂飼料喂養建立大鼠高脂血症模型。10周給藥後，分別測定實驗大鼠血脂、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）水平，主動脈血凝素樣氧化低密度脂蛋白（LOX-1）、P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）、核轉錄因子-κB（NF-κB） mRNA和蛋白表達；電鏡觀察主動脈內皮損傷情況。結果：M組血清膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）含量顯著升高（P[1]。目前，AS主要是靠藥物治療，牛樟芝（Antrodia cinnamomea，AC）作為一種真菌類中藥材，具有抗腫瘤、抗氧化、保肝、抗炎等功效[2]。目前，牛樟芝的效用在腫瘤及癌症方麵研究較為普遍，對主動脈內皮損傷研究甚少。本文旨在探討牛樟芝對高脂飲食大鼠主動脈內皮損傷相關基因表達的影響，從而為進一步明晰牛樟芝預防高脂飲食大鼠內皮損傷的機製提供理論依據。
1材料
1.1藥物 液態牛樟芝，上海市腫瘤研究所提供，使用時用0.9%的生理鹽水配置成25%的牛樟芝藥物溶劑。
1.2試劑與儀器 超氧化物歧化酶和丙二醛測試盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠主動脈LOX-1，P38MAPK，NF-κB酶聯免疫試劑盒（上海傑美GENMED醫藥科技有限公司）；Trizol核酸提取試劑、反轉錄PCR試劑盒和Real-time PCR試劑盒購自Takara寶生物（大連）有限公司。HITACHI 7170A全自動生化分析儀（日本日立公司）；EL×800全波長酶標儀（美國Bio-Tek公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國應用生物係統公司）；DYY 8C型電泳設備（北京市六一儀器廠）；電泳凝膠成像分析係統（英國Syngene公司）；SEM（S-4800）掃描電鏡（日本日立公司）。
1.3動物 清潔級雄性健康6周齡Sprague-Dawley大鼠50隻，體重（220±20） g ，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXK（京）2006-0009。
2方法
2.1高脂血症大鼠模型的建立及分組給藥方案 將50隻SD大鼠隨機分為5組：正常對照組（N組）、模型組（M組）、牛樟芝低（AC-L）、中（AC-M）、高（AC-H）劑量組，每組10隻。N組喂食基礎飼料，其餘各組給予高脂飼料（78.8%基礎飼料、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇、0.2%膽鹽）。造模同時，低、中、高劑量組每日以250，500，1 000 mg·kg-1牛樟芝溶劑灌胃，連續給藥10周。各組大鼠自由進食和飲水，室溫（20±3） ℃，濕度55%。每周日稱大鼠體重。
2.2血液和組織樣本采集 第10周末，所有大鼠均禁食過夜。用2%戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉。腹主動脈取血，3 000 r·min-1離心10 min，分離出血清分裝於Eppendorf管中，-20 ℃凍存待測。小心剝離大鼠腹主動脈，剔除結締組織，切下1/3迅速置於10%中性多聚甲醛溶液中固定，其餘部分迅速置於液氮中冷凍，並於-80 ℃超低溫冰箱保存待測。
2.3血脂指標和血清相關指標的測定 采用全自動生化分析儀測定血清中膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量；分光光度比色法測定血清中超氧化物歧化酶（SOD）的含量；TBA法測定血清中丙二醛（MDA）的含量。所有操作均嚴格參照試劑盒說明書進行。
2.4實時熒光定量PCR法檢測主動脈LOX-1，P38MAPK，NF-κB mRNA表達量 Trizol試劑提取主動脈組織總RNA，按照試劑盒說明書操作步驟，獲得cDNA產物，並進行PCR反應，β-actin為內參。引物序列檢索自NCBI-Nucloetide數據庫，采用Primesr5.0軟件設計，引物由上海生工生物公司合成。LOX-1，P38MAPK，NF-κB mRNA表達分析采用Real-time PCR SYBGreen熒光染料法測定，配置20 μL體係，具體操作參照試劑盒說明書，每個樣品3個重複。循環條件為：預變性 95 ℃ 30 s；PCR反應 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s（共40循環），95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。β-actin上遊引物TGTGAAATAGGGGCTGTG，下遊引物GGAAGAGGGAAGAACTGG；LOX-1上遊引物AAAAAGTCGGGAGAATTGCCTATC，下遊引物CCGGGTTTTTGCTTCTGGTCTT；P38MAPK上遊引物TTGGTCTGTTGGATGTGTTTAC，下遊引物TGGATTATGTCAGCCGAGTG；NF-κB上遊引物ATCTGTTTCCCCTCATCTTTCC，下遊引物TGGGTGCGTCTTAGTGGTATCT。軟件自動生成擴增曲線及融解曲線。2-ΔΔCt值法計算mRNA表達水平。