第六節 雙歧杆菌檢驗
一、概述
雙歧杆菌（Bifidobacterium，Bb）是1899年由法國學者Tissier從母乳營養兒的糞便中分離出的一種厭氧的革蘭陽性杆菌，末端常常分叉，故名雙歧杆菌。是人和哺乳動物回腸末端及大腸內最主要的生理性菌群，其分布在胃腸的數量隨年齡階段的增長而減少，分布最多的是母乳營養兒。雙歧杆菌有32個亞型。雙歧杆菌黏附於宿主腸道上皮後，定居成為穩定的菌群，形成生物學屏障，產生抗病原微生物、抑製腫瘤細胞物質，並能合成多種維生素，促進機體免疫機能等多種生理作用。由於具有重要的生理功能及對人體健康的有益作用，被廣泛開發應用於醫療、保健、食品等方麵。
二、生物學特性
（一）形態與染色
雙歧杆菌為革蘭染色陽性，形態多樣，可呈“V”形、“Y”形、彎曲狀、球拍狀、棍棒狀、球杆狀甚至球狀，無芽孢、莢膜和鞭毛，無運動性。一些雙歧杆菌初代培養為分叉狀，繼代培養變成杆狀，杆狀體在一定條件下又可變成分叉狀，其細胞壁不規則，凹凸不平，膨大或成團塊狀，有一個或多個分支。
（二）培養特性
專性厭氧，最適pH為6.7～7.0，最適生長溫度為36～38℃，在瓊脂培養基上菌落光滑，凸起，圓形，邊緣完整，乳白色，有光澤，質地柔軟。在液體培養基上呈彌漫狀生長，培養液渾濁，管底有小顆粒狀沉澱。
（三）生化反應
接觸酶陰性，硝酸鹽還原陰性，靛基質陰性，明膠液化陰性，精氨酸水解陰性。能分解葡萄糖，產生大量的乙酸和乳酸。
三、實驗室檢驗
（一）檢驗程序
（二）器材與試劑
1.器材氣相色譜儀配FID檢測器等。
2.試劑BL培養基、BBL培養基、PYG培養基、TPY培養基，API 50CH生化鑒定試劑盒。
（三）檢驗方法
1.以無菌操作將充分混勻的檢樣25g（ml）放入含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌錐形瓶內作成1∶10的均勻稀釋液。
2.用1ml滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內，振搖混勻，做成1∶100的稀釋液。
3.另取1ml滅菌吸管，按上述操作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增以次，即換用1支1ml滅菌吸管。
雙歧杆菌檢驗流程
4.選擇2～3個以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，各取0.1ml分別加入計數培養基平板，均勻塗布，每個稀釋度作兩個平板。最好同時選用2～3種培養基（BL、BBL、TPY培養基），同時作滅菌生理鹽水空白對照。
5.待瓊脂表麵幹後，翻轉平板，放至厭氧罐內，操作全過程須在20min內完成。
6.將厭氧罐36℃±1℃溫箱內培養72h±3h，觀察雙歧杆菌菌落特征。選取適當菌落數的平板對可疑菌落進行計數，隨機挑取五個可疑菌落進行革蘭染色、顯微鏡檢查和過氧化氫酶試驗。過氧化氫酶陰性，革蘭染色陽性、無芽孢、著色不均勻、出現“Y”或“V”形的分叉狀、棒狀等多形態的杆菌可定為雙歧杆菌。
7.菌落計數根據證實為雙歧杆菌的菌落數，計算出平板雙歧杆菌數，然後乘以樣品的稀釋倍數，得每毫升或每克樣品中雙歧杆菌數。取三種培養基中計數最高的為最終結果。例如，檢樣1×104倍的稀釋液在BBL瓊脂平板上，生成的可疑菌落為35個，取5個鑒定，證實為雙歧杆菌的是4個，則1ml（g）樣品中雙歧杆菌數為：
35×4/5×10×104=2.8×106
8.雙歧杆菌菌種鑒定
（1）生化實驗：
1）菌種製備：自平板上挑取菌落，接種於BL、BBL或TPY瓊脂平板上，置厭氧罐內，於36℃±1℃、72h±3h厭氧培養。刮取菌苔，製備菌懸液，濃度為109～1011CFU/ml，分別進行試驗。
2）生化鑒定試驗：雙歧杆菌一般不還原硝酸鹽（但當培養基有溶解的紅細胞時，可以還原硝酸鹽），不產靛基質和硫化氫。常見雙歧杆菌碳水化合物反應。
3）商品化生化鑒定係統：可選擇使用商品化的生化鑒定係統進行鑒定，如API 50CH生化鑒定試劑盒。
（2）氣相色譜法分析雙歧杆菌有機酸代謝產物：
1）雙歧杆菌培養液製備：挑取BBL瓊脂上純培養菌接種PYG液體培養基，同時用未接種菌的PYG液體培養基做空白對照，嚴格厭氧，36℃±1℃培養72h±3h。
2）乙酸標準溶液配製：準確吸取乙酸5.7ml加水稀釋至100ml，搖勻，配成約1.0mol/L的乙酸標準溶液。乙酸使用液：將經標定的乙酸標準溶液用水稀釋至20.0mmol/L。
3）乳酸標準溶液配製：準確吸取含量為85％～90％的乳酸0.84ml，加水稀釋至100ml，搖勻，配成1.0mol/L的乳酸標準溶液。乳酸使用液：將乳酸標準溶液用水稀釋至20.0mmol/L。
4）乙酸處理：取雙歧杆菌培養液2～3ml放入10ml離心管中，加入0.2ml 50%硫酸溶液，混勻，加入2ml丙酮，混勻後加過量氯化鈉，劇烈振搖1min，再加入2ml乙醚，振搖1min後，3000r/min離心5min，將上清液轉入另一試管中，下層溶液用2ml丙酮和2ml乙醚重複提取2次，合並有機相，於40℃水浴中用氮氣吹至少量溶液存在，用丙酮定容至1ml，混勻後備用。同樣操作步驟處理乙酸標準和空白培養液。
5）乳酸處理：取雙歧杆菌培養液2～3ml放入10比色管中，100℃水浴10min，加入0.2ml 50%硫酸溶液，混勻，加入1ml甲醇，於58℃水浴30min後加水1ml，加三氯甲烷1ml，振搖3min，3000r/min離心5min，取三氯甲烷層分析。同樣操作步驟處理乳酸標準和空白培養液。
6）氣相色譜條件：
色譜柱：長2m，內徑4mm的玻璃柱，填裝塗有20%DNP+7%Tween60的chromosorbwHP（80～100目）；柱溫：110℃；汽化室：150℃；檢測器：150℃；載氣：（N2）50ml/min；進樣量1.0μl；外標法峰麵積定量。
乳酸和乙酸標準
計算公式:
X=（A樣-A空）/A標×C
式中：X為樣品培養液中乙酸或乳酸的含量，單位為每毫升微摩爾（μmol/ml）；A樣為樣品培養液中乙酸或乳酸的峰麵積；A空為空白培養液中乙酸或乳酸的峰麵積；A標為乙酸標準或乳酸標準的峰麵積；C為乙酸標準或乳酸標準的濃度，單位為微摩爾每毫升（μmol/ml）。
允許差：相對相差≤15%。結果判定：雙歧杆菌的有機酸代謝產物，乙酸（μmol/ml）與乳酸（μmol/ml）比值大於1。
（楊小蓉）
第七節 黴菌檢驗
黴菌種類繁多，廣泛分布於土壤、空氣、糧食等自然環境和動植物體內外，與人類生產生活關係密切。有益黴菌大量應用於傳統釀造業、食品加工業和現代微生物發酵工業。有害黴菌或真菌在臨床上引起皮膚病和機會感染；在自然環境中導致人類生產生活用品黴變，造成巨大經濟損失；在糧食和食品中產生毒素，對人類健康造成危害。
黴菌屬於低等真核生物，其形態構造、生長繁殖條件和方式與細菌不同，分離鑒定方法也和細菌等其他微生物不同，有其獨特性。
一、概述
（一）黴菌的分類
黴菌是真菌中的一大類，是絲狀真菌的俗稱，其基本特征符合真菌的定義，即是一大類細胞結構完整，有明顯的細胞核、細胞壁，不含葉綠素，無根、莖、葉的分化，大多由分枝或不分枝的多細胞菌絲組成，能通過無性或有性生殖產生各種孢子進行繁殖，營腐生或寄生的微生物。從生物進化看，黴菌是低等真核生物和高等微生物，其主要特點：具有發達的菌絲體並可肉眼觀察，通過產生大量孢子進行繁殖，營養為異養吸收型，陸生性強，不能進行光合作用。