正文 第十章 衛生微生物檢驗(四)(2 / 3)

黴菌種群分布在真菌界以生物命名法則命名的多個門類中,根據Ainsworth真菌分類係統,黴菌或產毒黴菌主要分布在半知菌亞門、接合菌亞門和子囊菌亞門中,如黃曲黴(A.flavus)屬於真菌門、半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科、曲黴屬。在黴菌的常規檢驗鑒定中,一般將菌種檢索歸類到屬(群)。

(二)黴菌的一般特征

黴菌為真核生物,由單細胞或多細胞構成,細胞基本結構由細胞壁、細胞膜、細胞質、細胞核、線粒體、核糖體等細胞器構成。

1.形態與結構一般由菌絲或菌絲體和孢子組成。

(1)菌絲與菌絲體:黴菌營養體為菌絲,管狀,直徑一般為2~10μm,長度可達數毫米至數十毫米,按形態結構可分為無隔和有隔菌絲兩種,無隔菌絲為長管狀單細胞,內含多個細胞核,其生長表現為菌絲的延長和細胞質的增加,如根黴、毛黴等;有隔菌絲由橫隔膜分成成串的多細胞,每個細胞內含一個或多個細胞核,分枝或不分枝,多數黴菌屬此類,如曲黴、青黴等。黴菌在適宜培養基上生長的菌絲相互交織形成菌絲團,稱為菌絲體,根據菌絲體位置和功能可分為兩個類型,生長於培養基內部,行使吸收營養功能的菌絲稱為營養菌絲或基內菌絲;伸出培養基外的菌絲稱為氣生菌絲或繁殖菌絲。在一定生長階段,部分營養菌絲體可分化為假根、附著枝、菌核等特定結構,氣生菌絲則分化為繁殖菌絲,進行有性或無性繁殖,如分生孢子頭、孢子囊、分生孢子器、子囊果等。無論營養菌絲體還是氣生菌絲體,在一定階段會呈現多種顏色,有些會分泌到培養基中,菌絲體的顏色和分化的特殊構造對不同的黴菌具有鑒別特征。

(2)孢子:為黴菌的繁殖體,由特化的氣生菌絲產生,分為有性孢子和無性孢子兩大類。有性孢子由同一或不同菌絲體上兩個細胞融合產生,形成卵孢子、接合孢子、子囊孢子等;無性孢子由氣生菌絲頂端細胞分化產生,形成分生孢子、孢囊孢子、厚垣孢子、節孢子等,一條菌絲可產生多個孢子。

黴菌孢子的特點:小、輕、多、幹,形態色澤各異,休眠期長,抗幹燥、抗輻射和耐營養貧乏能力強。孢子的形態多樣,是黴菌鑒定主要指標之一,常見有球形、卵形、橢圓形、鐮刀形、腎形、針線形等。

2.菌落特征黴菌在固體培養基上(平板或斜麵)生長形成的菌落一般較大,直徑以cm計,部分黴菌生長快且蔓延至整個平板;菌落質地疏鬆、外觀幹燥、不透明,呈現緊密或鬆散的蛛網狀、絨毛狀、絮狀等;菌落與培養基連接緊密,不易挑起;菌落正反麵、邊緣與中心的顏色常不一致,一般生長初期菌落或菌絲體為無色或白色,隨著培養時間的延長而出現顏色並有由淺而深的變化。

二、黴菌培養

黴菌分離鑒定依賴於培養基和培養條件的選擇與控製。

(一)主要培養基及用途

1.馬丁(Martin)瓊脂培養基

(1)成分:蛋白腖5g,葡萄糖10g,磷酸二氫鉀1g,硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g,瓊脂20g,1/30000孟加拉紅水溶液100ml,蒸餾水900ml。

(2)製法:按上述配方配製,110℃滅菌20min,臨用前每毫升培養基加鏈黴素30μg。

(3)用途:適用於各種黴菌生長,可用於一般黴菌計數和分離。

2.孟加拉紅培養基(虎紅培養基)用於土壤、食品、化妝品等樣品黴菌計數和分離。

3.察氏培養基用於曲黴、青黴、鐮刀菌等黴菌的鑒定和菌種保存,不適宜於根黴的分離培養。

4.馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)適宜於各種黴菌生長,主要用於鐮刀菌、根黴等的分離鑒定和菌種保存。

5.麥芽汁瓊脂

(1)成分與製法:糖化麥芽汁(6~12P)1000ml,瓊脂15g。121℃滅菌30min。

麥芽汁可從啤酒廠購買,也可自製備:取普通大麥浸泡24h,置於木框內,覆蓋濕紗布,置20℃左右環境中,至麥芽長度為初麥1~1.5倍,烘幹磨粉。取幹粉1000g,加水3000ml,55℃保溫糖化至加碘不顯藍色,煮沸30min,沉澱蛋白質,調pH中性,紗布過濾,靜置過夜,取上清液,用波美計測定糖度。

(2)用途:適用於各類黴菌分離鑒定和菌種保存,常用於根黴鑒定。

6.大米粉培養基用於黴菌產毒培養。

(二)培養條件

1.溫度常見黴菌或產毒黴菌屬中溫菌,最適生長溫度一般為25~30℃,實驗室常采用28℃培養。為提高個別黴菌分離的選擇性,可提高或降低培養溫度,如煙曲黴可置45℃培養。當對產毒黴菌進行產毒培養時,可略低於生長溫度,如黃曲黴最適生長溫度為37℃,而產毒時則為28~32℃。當進行分離鑒定時需選擇最適生長溫度,而進行產毒培養時,則初期控製最適生長溫度,後期適當降低培養溫度。

2.濕度黴菌在高濕度或高水活性的基質中旺盛生長和代謝,嗜旱性強的青黴和曲黴,在幹燥基質中可以生長,但生長速度緩慢,其菌絲體和孢子形態結構會發生變化,與其模式種描述不能吻合,因此,在進行黴菌分離鑒定和產毒培養時,須提供較高水分的培養基質和環境,如培養平板倒置、小培養時提供高濕環境、產毒培養的糧食碎粒基質的水分約50%。

3.通氣黴菌為需氧菌,在培養過程中需提供充足的氧氣,平板和斜麵按常規培養方式可滿足氣體需求;載玻片小培養時,必須讓蓋玻片和載玻片之間留有一定通氣空間;產毒培養的基質需含有疏鬆介質,如一定量的糧食碎粒、麩皮、糠殼等,以便通氣。

三、黴菌的接種與觀察

黴菌實驗室接種與觀察不同於細菌,分離純化不能采用劃線法。

(一)樣品接種與分離

1.樣品分離接種土壤、健康相關產品、糧食表麵黴菌分離和汙染計數可采用稀釋傾注平板法(國家標準方法GB/T4789.15-2003)和塗布法,常用孟加拉紅瓊脂或PDA;若分離產毒黴菌應選擇察氏培養基,可避免根黴等非產毒菌株快速生長和大量繁殖,影響分離效果。空氣黴菌檢測可采用自然沉降法或氣體撞擊法。

糧食內部黴菌分離:用消毒酒精和無菌水消毒清洗糧食表麵汙染黴菌後,將糧食粒點種於平板上,每皿5~10粒,糧食黴菌菌相多為嗜旱性黴菌,需采用察氏培養基或高鹽察氏培養基。

2.菌株純化分離在分離平板上形成的各種分散的菌落,根據形態特征可初步判定類群,用接種環或接種針直接蘸取目標菌落中心部位的孢子或挑取菌絲,點種於相應平板或斜麵上,經培養觀察,可判定菌株是否純化,也可進行菌落特征觀察,進入鑒定程序。在進行純化分離接種時,動作宜輕、慢、穩,避免雜菌孢子汙染。

(二)菌株鑒定接種與觀察

主要觀察和記錄菌株的菌落特征和個體形態,接種方法多樣,應選擇擬定類群適宜的培養基進行培養,青黴和曲黴選用察氏或高鹽察氏培養基,鐮刀菌選用PDA或察氏培養基,其他黴菌可選擇PDA、麥芽汁培養基、沙氏培養基等。

1.點種平板將擬鑒定菌株點種於平板上,每皿1~3點,局限生長類黴菌3點,如青黴、曲黴等;快速生長大菌落類1點,如根黴、毛黴等。經培養,可觀察菌落特征;製備顯微觀察玻片,記錄個體形態。該法是黴菌鑒定中菌落特征觀察描述的首選方法。

2.點種斜麵將擬鑒定菌株點種於斜麵,經培養用於觀察部分菌落形態特征;低倍顯微鏡下觀察部分個體形態特征;保存菌種。斜麵點種有減少實驗過程中黴菌孢子汙染的優點。