北柴胡花藥愈傷組織高效再生體係的建立
資源與鑒定
作者：徐潔森 趙立子 魏建和 陶韻文 孫晶 隋春 楊成民
[摘要] 以花粉發育處於單核期的北柴胡花藥為外植體誘導出愈傷組織，愈傷組織經多次繼代培養後，置於20種含不同植物激素的分化培養基上誘導分化。分別在培養21，49 d後，統計每種培養基中分化出苗數，同時觀察再生植株生長狀況，從中篩選出分化率高，分化速度快，且植株生長狀態良好的分化培養基。結果共在19種培養基均可分化出苗，分化率在3%～60%，大部分低於20%。在MS+KT 0、5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+植物凝膠5 g·L-1培養基上分化率最高，為60%，其次為MS+ ZT 1、0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+植物凝膠5 g·L-1，為58%。另外，針對在分化培養基中未能生根的再生芽，進行了生根培養基篩選。結果顯示再生芽在生根培養基MS+蔗糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1和1/2 MS+ NAA 0、5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1中均可生根，生根率均為100%。由此建立了北柴胡花藥愈傷組織高效穩定的再生體係。
[關鍵詞] 北柴胡；愈傷組織；再生體係
[稿件編號] 2013-04-03
[基金項目] 國家自然科學基金項目（）；北京市自然科學基金項目（）；中醫藥行業科研專項（）
[通信作者] * 隋春，副研究員，Tel：（010）， E-mail：csui@implad、ac、cn 北柴胡Bupleurum chinense DC、為傘形科柴胡屬植物，是《中國藥典》（2010年版）規定的藥用柴胡的基原之一，具有解表退熱、疏肝解鬱、升舉陽氣的功效。植物組織培養再生體係在植物尤其是珍稀瀕危物種的快速繁殖等方麵有廣泛應用，也是植物轉基因研究的基礎。對於北柴胡的組織培養再生體係的研究已有報道，如姚智等[1]以無菌苗為外植體誘導出了北柴胡愈傷組織，並對北柴胡愈傷組織生長和不定根誘導的條件進行了探討；郝建平等[2]對北柴胡葉片、莖段和花芽進行了愈傷組織誘導、分化及不定芽增殖條件的研究。本實驗室楊成民等[3]也誘導出了北柴胡花藥愈傷。花藥離體培養是植物進行單倍體誘導的有效途徑之一。目前，許多藥用植物已利用花藥培養獲得單倍體，如丹參Salvia sclarea L、、毛地黃Digitalis purpurea Linn、、西洋參Panax quinquifolius L、、寧夏枸杞Lycium barbarum L、、人參Panax ginseng C、 A、 Mey、、平貝母Fritillaria ussuriensis Maxim、等[4-9]。在傘形科植物中，胡蘿屬胡蘿卜Daucus carota L、、茴香屬茴香Foeniculum vulgare Mill、、鴨兒芹屬鴨兒芹Cryptotaenia japonica Hassk、、芹屬旱芹Apium graveolens L、也已通過花藥培養再生出單倍體苗[10-11]。而柴胡屬中三島柴胡B、 falcatum L、已通過花藥培養獲得單倍體，但胚性愈傷和植株再生率仍然較低[12-14]。
本研究首先參考以往報道，以花藥愈傷誘導植株分化，分化出芽的極少，而分化出了大量根。以北柴胡處於單核期的花藥為外植體誘導愈傷組織，設計含有不同種類、不同濃度外源植物激素的20種分化培養基，對北柴胡花藥愈傷分化出苗的最佳條件進行了篩選，以建立其高效穩定的再生體係，柴胡高效穩定再生體係的建立，將為通過轉基因研究北柴胡基因功能奠定重要基礎，也將為柴胡種質擴繁等研究應用提供借鑒參考。
1 材料
植物材料為本實驗室選育的北柴胡B、 chinense新品種“中柴2號”，取花粉發育處於單核期的花蕾為外植體。
2 方法
2、1 北柴胡愈傷組織的誘導
花藥愈傷組織誘導：參考楊成民等報道[3]，將采摘的花蕾於7 ℃冰箱冷藏3 d，70%乙醇處理1 min，無菌水潤洗1次，然後用6%次氯酸鈉溶液處理20 min，無菌水潤洗3遍。接種前用無菌濾紙吸幹水分，剝出花藥，去除花絲，接種於MS+2，4-D 1、2 mg·L-1 +穀氨酰胺0、4 g·L-1 +水解酪蛋白0、2 g·L-1 +麥芽糖30 g·L-1 +植物凝膠3、5 g·L-1的培養基中，25 ℃暗培養，誘導愈傷組織形成。
2、2 愈傷組織的增殖
將誘導出的花藥愈傷組織置於繼代培養基MS+2，4-D 1、0 mg·L-1+6-BA 0、1 mg·L-1+穀氨酰胺0、4 g·L-1+水解酪蛋白0、2 g·L-1+甘露醇3 g·L-1+麥芽糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1中增殖，25 ℃暗培養，14～21 d繼代1次。
2、3 愈傷組織的再分化
在繼代培養的愈傷組織中挑選出結構致密、淡黃色顆粒狀的幹爽胚性愈傷組織，切成0、5 cm2小塊，分別接種於不同分化培養基上（表1），每培養皿接種10塊愈傷組織。培養室以日光燈為光源，光照度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，溫度25 ℃。接種21 d後觀察並統計分化率，並將尚未分化愈傷組織更新培養基後再培養28 d後再次統計分化率，並統計平均每塊愈傷出芽數。分化率=（有芽的愈傷組織塊數/ 接種愈傷組織總塊數）×100%，每塊愈傷出芽數=再生芽總數/有芽的愈傷組織塊數。
2、4 小苗生根培養
分化出的小苗葉片長至高2～3 cm時，將其轉至生根培養基中生根，光照度1 500～2 000 lx，每天光照12 h，溫度25 ℃。3種培養基為：①MS+蔗糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1，②1/2 MS+ NAA 0、5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1，③1/2 MS+IBA 0、5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1。
3 結果與分析
3、1 北柴胡花藥愈傷組織增殖
新誘導出的花藥愈傷置於MS+2，4-D 1、0 mg·L-1+6-BA 0、1 mg·L-1+穀氨酰胺0、4 g·L-1+水解酪蛋白0、2 g·L-1+麥芽糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1中繼代約18周後，愈傷質地疏鬆、含水量較大。選擇部分愈傷組織轉移至1/2 MS+6-BA 0、2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+植物凝膠5 g·L-1（C1）和6-BA 1、0 mg·L-1+NAA 0、03 mg·L-1（D1）分化培養基中，光照培養2～4周後愈傷大量分化出根，繼續培養無幼苗生成。分析可能與愈傷自身狀態有關，因此改良了繼代培養基，在愈傷繼代培養基中添加不同濃度的甘露醇。繼代2次後，可觀察到在MS+2，4-D 1、0 mg·L-1+6-BA 0、1 mg·L-1+穀氨酰胺0、4 g·L-1+水解酪蛋白0、2 g·L-1+甘露醇3 g·L-1+麥芽糖30 g·L-1 +植物凝膠5 g·L-1培養基中愈傷生長快，愈傷質地致密。選擇此培養基為繼代培養基，繼續繼代20周。