四物湯及其配伍對大鼠肝髒P450酶活性及mRNA表達的影響
藥理
作者：梁淼 馬增春 易劍峰 王宇光 譚洪玲 肖成榮 梁乾德 湯響林 李樺 沈國林 高月
[摘要] 研究四物湯複方及其配伍對大鼠肝髒P450酶活性及其mRNA表達水平的影響。大鼠口服灌胃四物湯及其配伍水煎液2周後，處死，用生理鹽水灌流肝髒，製備肝微粒體，采用混合探針與肝微粒體體外孵育法考察四物湯對大鼠肝髒細胞色素P450酶的影響。利用實時定量聚合酶鏈式反應（Q-PCR）檢測四物湯對大鼠肝髒細胞色素P450 mRNA表達的影響。四物湯複方組CYP1A2酶活性與對照組相比升高（P-1·d-1，其他各組給藥劑量按其在複方中所占比例等量換算（熟地-當歸-白芍-川芎15∶10∶10∶6）。空白組給予等量生理鹽水，連續灌胃14 d後，處死動物製備肝微粒體並提取動物肝髒總RNA。
1、3 儀器 Agilent 1290型超高效液相色譜儀（UHPLC，美國Agilent公司）；Agilent 6410B型三重四極杆串聯質譜儀（美國Agilent公司）；Agilent ZORBAX EclipsePlus-C18色譜柱（2、1 mm×100 mm，3、5 μm，美國Agilent 公司）；RE52CS型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；SHB-ⅢA循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；BS 223S型電子天平[塞多利斯科學儀器（北京）有限公司]；ABI Step One Plus熒光定量PCR儀。
2 方法
2、1 供試樣品的製備四物湯水煎液按《太平惠民和劑局方》規定的劑量稱取組成，熟地15 g，當歸10 g，白芍10 g，川芎6 g，共計41 g·d-1。按《中藥藥理研究方法學》計算大鼠的等效劑量為5 g·kg-1·d-1。經水煎、過濾、濃縮、配製成100%藥液（即每1 mL藥液含生藥1 g），各單味及兩兩配伍各組藥按同樣的方法均配製成相當於四物湯（1 g·mL-1）的濃度，即每種藥液濃度均與其在複方中濃度一致（按生藥量計熟地0、366 g·mL-1，當歸0、244 g·mL-1，白芍0、244 g·mL-1，川芎0、146 g·mL-1）。置於4 ℃保存備用。
2、2 肝微粒體的製備大鼠脫臼處死，迅速剪開心髒，用注射器以4 ℃生理鹽水由門靜脈灌洗，結紮上腔靜脈，灌洗至肝髒呈土黃色。采用差速離心法製備，將肝髒剪碎，按1∶4加入TMS緩衝液，冰浴中勻漿。勻漿液4 ℃，12 000×g離心20 min，棄沉澱。上清液4 ℃，105 000×g離心60 min，棄上清，沉澱部分即微粒體。按初始勻漿時每克肝組織加入1 mL Tris-HCl儲存液（4 ℃），重懸微粒體，冰浴，玻璃勻漿管手動研磨，使微粒體均勻分散。分裝微粒體。-80 ℃保存。采用BCA法測定肝微粒體蛋白濃度。
2、3 總RNA提取及鑒定大鼠處死後迅速取出肝髒，置於液氮中保存。按RNA提取試劑盒說明書提取肝髒總RNA。紫外分光光度計法測定RNA濃度，A260/A280在1、7～1、9，電泳分析表明18S和28S條帶清晰可見，總RNA片段完整未降解可用。
2、4 逆轉錄及實時定量聚合酶鏈式反應（Q-PCR）取總RNA 1 μg，分別加入2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，Anchored Oligo（dT）18 1 μL，加RNase-free Water至終體積為20 μL並混合均勻。反轉錄的條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，進行擴增反應並在-20 ℃保存待用。逆轉錄產物2 μL，加入2×TransStart Green qPCR SuperMix 10 μL，Forward Primer 0、4 μL，Reverse Primer 0、4 μL，Passive Reference Dye 0、4 μL，加ddH2O 補足反應體係至20 μL，熒光實時定量PCR的條件為94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。以β-actin作為內參基因，進行PCR擴增的實時定量分析。mRNA表達水平采用比較閾值法進行定量分析，所擴增的目的基因誘導或抑製的倍數= 2-ΔΔCt，即RQ值。ΔΔCt=實驗組ΔCt（目的基因Ct-內參基因Ct）-對照組ΔCt（目的基因Ct-內參基因Ct），Ct值為測定的達到熒光閾值的循環數[9]。實驗重複測定3次。特異性引物序列。
2、5 液質聯用檢測條件液相條件：以流動相A（含0、1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸銨的純水）和B（含0、1%甲酸的乙腈）梯度洗脫，30%B（0 min），95%B（1、5～3、5 min），30%B（3、6 min）；柱溫25 ℃，流速0、45 mL·min-1，運行時間4、5 min，進樣體積10 μL。內標為普奈洛爾（100 μg·L-1）。