黃連HPLC數字化指紋圖譜研究及7種生物堿含量測定
化學
作者：劉芳 張浩 青琳森
[摘要] 該文建立了峨眉地區道地藥材黃連的HPLC數字化指紋圖譜，並將其在全國不同主產區的黃連測定中進行了應用，同時測定黃連中7種季胺型生物堿的含量，為科學評價與有效控製黃連質量提供依據。采用Diamonsil C18色譜柱（4、6 mm×250 mm，5 μm），流動相乙腈-0、025mol·L-1KH2PO4溶液（磷酸調pH 3、0）（40∶60），內含SDS 1、7 g·L-1，流速1、2 mL·min-1，檢測波長345 nm，柱溫40 ℃。運用中藥色譜指紋圖譜相似度評價係統（國家藥典委員會）進行分析，10批次峨眉產黃連樣品得到的指紋圖譜相似度均大於0、99，標定共有峰10個，並對其中8個色譜峰進行了歸屬。全國5個黃連主產區樣品與峨眉產黃連進行相似度分析比較，整體相似度高。同時對黃連藥材中groenlandicine，非洲防己堿，藥根堿，表小檗堿，黃連堿，巴馬汀，小檗堿7種主要生物堿進行了含量測定。該方法靈敏度高、專屬性強，HPLC指紋圖譜結合生物堿含量測定能全麵反應其內在質量，為黃連的質量控製提供科學依據。
[關鍵詞] 黃連；HPLC；指紋圖譜；含量測定
[收稿日期] 2013-05-03
[基金項目] 科技部國家科技支撐計劃重點項目（2007BA140B05）；中國博士後科學基金第6批特別資助項目（2013T60863）
[通信作者] *張浩，教授，博士生導師，Tel：（028），E-mail：zhanghhx@vip、sina、com 黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch、的幹燥根莖，常用中藥材，主產於四川峨眉、洪雅、彭州，重慶石柱、巫山，湖北利川等地[1]，其中峨眉曆來是黃連的道地主產區，栽培曆史悠久，在曆代本草《名醫別錄》、《唐本草》、《本草綱目》等中均有記載[2]。黃連中所含的生物堿主要有小檗堿、巴馬汀、黃連堿、表小檗堿、藥根堿等[3-4]季胺型生物堿。小檗堿及其衍生物除了具有抗炎抗菌[5-6]的作用外，還在治療腫瘤[7-10]、糖尿病[11-14]、心血管疾病[15-16]、高血脂[17]、腦缺血性損傷[18]等多方麵具有藥理作用。中藥的化學成分複雜，在質量控製中采用單一成分或某幾個成分難以反映中藥材的整體特征，建立簡便可行的指紋圖譜方法，確定其特征的共有峰圖譜，是從整體上控製其質量已成為普遍運用的方法[19-21]。本文采用HPLC，選擇了四川峨眉地區具代表性的10批次黃連藥材樣品進行了分析測定，以生物堿類成分作為評價指標，建立了峨眉山地區黃連藥材的生物堿指紋圖譜，確定了10個共有峰，其分離度和重現性均較好，同時測定了7種季胺型生物堿的含量。並且為了準確反應與評價生物堿類成分在黃連內的形成、積累等與環境影響因素的關係，本文將所建立的方法在全國不同主產區進行了應用，結果表明整體相似度均在0、99以上，但在生物堿的含量上存在較大差異。
1 材料
Shimadzu LC-10Atvp高效液相色譜儀（LC-10Atvp泵、SPD-10Avp紫外檢測器、CTO-01Asvp柱溫箱、SCL-10Avp係統控製器、Class-vp色譜工作站）；Diamonsil C18色譜柱（4、6 mm×250 mm， 5 μm）；中藥色譜指紋圖譜相似度評價係統（中國藥典委員會 2004A）； BP211D 1/10萬電子天平（德國Sartorius公司）； KQ3200超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，工作頻率40 kHz，超聲功率120 W）；pH計（PHS-3C型，上海雷磁）。
乙腈（美國Fisher公司）色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。
黃連對照藥材、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；黃連堿、表小檗堿、非洲防己堿、groenlandicine、木蘭花堿由作者分離、純化製備，並經紅外、紫外、核磁、質譜鑒定，純度均達99%（相對純度）以上。
黃連藥材由作者采集及四川大學華西藥學院標本室提供，經四川大學華西藥學院生藥教研室張浩教授鑒定為黃連C、 chinensis的幹燥根莖，。
表1 黃連藥材樣品
Table 1 Samples of Coptidis Rhizoma
No、采集地點No、采集地點1四川峨眉山市龍池鎮高萬村9四川峨眉山市川主鄉荷葉村2四川峨眉山市龍池鎮陶淵村10四川峨眉山市大為鎮中山村3四川峨眉山市龍池鎮金川村11四川彭州白鹿鎮4四川峨眉山市龍池鎮富友村12四川峨眉山市洪雅高廟5四川峨眉山市沙溪鄉林壩村13湖北利川6四川峨眉山市高廟鎮黃茅村14四川巫山7四川峨眉山市高橋鎮張溝村15重慶石柱8四川峨眉山市龍門鄉楊林村
2 方法與結果
2、1 色譜條件
流動相為乙腈-0、025 mol·L-1KH2PO4溶液（磷酸調pH 3、0）（40∶60），內含十二烷基硫酸鈉（SDS）1、7 g·L-1；檢測波長345 nm ；流速1、2 mL·min-1 ；柱溫40 ℃；進樣量5 μL。
2、2 對照品溶液的製備
分別精密稱取鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸藥根堿、黃連堿、表小檗堿、groenlandicine、非洲防己堿適量於10 mL量瓶中，加甲醇-鹽酸（100∶1）溶解並稀釋至刻度，其質量濃度分別為1、772，0、193，0、384，0、300，0、300，0、261，0、234 g·L-1，作為對照品儲備液。
2、3 供試品溶液的製備
取黃連根莖細粉（過40目篩，幹燥至恒重）約0、1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇-鹽酸（100∶1）溶液50 mL，稱定總質量，冷浸過夜，超聲提取60 min，補足失重，搖勻，0、45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液備用。
2、4 黃連藥材HPLC指紋圖譜的建立
2、4、1 精密度試驗取同一供試品溶液（S1）連續進樣5次，記錄色譜圖，以小檗堿色譜峰為參照峰，計算指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰麵積，結果各共有峰的相對保留時間的RSD-1的溶液中，加入不同濃度（0、01～0、05 mol·L-1）KH2PO4作為流動相，345 nm檢測。分別取groenlandicine、非洲防己堿、藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿7種生物堿對照溶液進樣，測定tR，並以容量因子k′的倒數對KH2PO4濃度作圖。
圖4 流動相中KH2PO4濃度對k′-1的影響
Fig、4 The influence of concentration of KH2PO4 on capacity factor （k′-1）
從圖4可以看出，當KH2PO4濃度大於0、03 mol·L-1時，藥根堿與表小檗堿的色譜峰完全分離，但藥根堿與非洲防己堿的色譜峰出現部分重合，當KH2PO4濃度為0、05 mol·L-12個色譜峰完全重合；當KH2PO4濃度小於0、025 mol·L-1時，藥根堿、表小檗堿和非洲防己堿的色譜峰三者可基本完全分離，但隨著KH2PO4濃度的降低，小檗堿色譜峰的保留時間也隨之延長。當KH2PO4濃度為0、01 mol·L-1時，小檗堿色譜峰的tR=94 min。在KH2PO4濃度為0、025 mol·L-1時藥根堿、表小檗堿和非洲防己堿的色譜峰三者可基本完全分離，小檗堿保留時間也適當，小檗堿吸收峰的tR=51 min。所以，確定0、025 mol·L-1為KH2PO4的最佳濃度。
1.小檗堿；2.巴馬汀；3.黃連堿；4.表小檗堿；5.藥根堿；6.非洲防己堿；7.groenlandicine ；8.木蘭花堿。
圖5 黃連藥材色譜圖
Fig、5 The chromatograms of Coptidis Rhizoma
3、1、2 流動相中SDS濃度的影響邱曉星，晁若冰等[21-22]就SDS濃度對黃連藥材中生物堿的分離度的影響進行了詳盡的考察。在其研究基礎上，本文僅考察乙腈-0、025 mol·L-1KH2PO4溶液（磷酸調pH為3、0）（40∶60）溶液中，加入1、70，3、40 g·L-1 SDS溶液的差異。結果發現，隨著SDS濃度的增加，各生物堿的保留時間均有所減少，但當SDS為3、4 g·L-1時，藥根堿與非洲防己堿的色譜峰完全重合。因此確定SDS的最佳質量濃度為1、7 g·L-1。