滿天星異葒草苷對大鼠酒精性肝纖維化保護作用的實驗研究
藥理
作者：陳永欣 黃權芳 林興 韋錦斌
[摘要] 目的：研究滿天星異葒草苷對乙醇誘導形成的大鼠肝纖維化的幹預作用及其機製。方法：90隻雄性大鼠隨機分為6組，分別為正常對照組、模型對照組、秋水仙堿組（灌胃給予秋水仙堿1、0 mg·kg-1·d-1）、異葒草苷低、中、高劑量組（灌胃給予異葒草苷25，50，100 mg·kg-1·d-1）。實驗過程中，模型組大鼠僅灌胃給予白酒，治療組在給白酒的同時灌胃相應的藥物，正常組則隻灌胃等量的生理鹽水。給藥24周後，各組大鼠眼球取血、取肝髒，並測定血漿白細胞介素-6（IL-6），人腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和血清穀丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、透明質酸（HA），層粘連蛋白（LN），Ⅲ型膠原（PCIII）和羥基脯氨酸（Hyp）的含量，檢測肝組織髓過氧化物酶（MPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和穀胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，Western blot檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和轉化生長因子-β1（TGF-β1）的表達，以及肝組織病理檢查。結果：異葒草苷能夠保護受損的肝組織，降低ALT，AST，IL-6，TNF-α，MDA，MPO，HA，LN，PCIII和Hyp的含量（P-1·d-1；5～8周，7、0 g·kg-1·d-1；9～12周，9、0 g·kg-1·d-1；13～24周，9、5 g·kg-1·d-1。在造模過程中，秋水仙堿組每天灌胃給予秋水仙堿1、0 mg·kg-1，異葒草苷低、中、高劑量組每天分別灌胃給予異葒草苷25，50，100 mg·kg-1。對照組和模型組則灌胃給予生理鹽水。連續給藥24周後，所有動物均從眼球取血，處死，快速分離肝組織，立即用冰冷生理鹽水清洗以除去過多的血，一部分於-80 ℃保存，其餘立即放入10%福爾馬林溶液中固定。
2、2 肝組織病理檢查肝組織分離後，取一部分馬上放入10%的福爾馬林溶液中固定，常規脫水、石蠟包埋，組織切片，H&E染色，做病理切片檢測。
2、3 血清中ALT，AST活性測定血清中ALT，AST的活性采用試劑盒進行檢測。
2、4 血漿中IL-6，TNF-α和肝組織MPO活性測定血漿中IL-6和TNF-α采用夾心酶聯免疫吸附試驗法（ELISA法），嚴格按照試劑盒說明書進行操作。肝組織髓過氧化物酶（MPO）活性參考Ersahin M [3]的方法進行檢測。
2、5 肝髒抗氧化酶和脂質過氧化作用測定肝組織中SOD，GSH-Px含量用於抗氧化劑的測定，其活性采用黃嘌呤氧化酶法測定；MDA含量用於測定脂質過氧化反應，其活性采用硫代巴比妥酸法測定[4]，具體步驟均按照各試劑盒說明書操作。
血清中HA，LN，PCIII的含量采用放射免疫測定法（RIA）檢測。肝組織中Hyp的含量測定嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。
2、6 Western blot檢測肝組織中α-SMA表達水平用總蛋白提取試劑盒提取各組肝組織的總蛋白，Bradford法對蛋白樣品進行定量。取出30 μg蛋白樣品至EP管中，加入4×SDS上樣緩衝液至終濃度為1×SDS，95 ℃煮10 min進行蛋白質變性，再進行100 g·L-1的SDS-PAGE凝膠電泳，然後將蛋白質轉至硝酸纖維膜上，用50 g·L-1的脫脂牛奶於4 ℃封閉過夜後，分別用α-SMA抗體（1∶200），β-actin （1∶1 000）4 ℃孵育過夜，然後加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠-IgG抗體（1∶1萬）室溫2 h。最後加ECL發光劑於暗室充分反應後用膠片曝光。將每個樣本所測得的α-SMA蛋白灰度值，分別與對應的β-actin蛋白的灰度值相比，計算二者灰度比值。
2、7 肝組織中TGF-β1的檢測分別取各組50 mg肝組織，加1 mL蛋白裂解液（裂解液組成：50 mmol·L-1 Tris，150 mmol·L-1 NaCl，5 mmol·L-1 EDTA，0、1% SDS，1% NP-40，1 mg·L-1Aprotinin，1 mg·L-1Leupeptin，1 mg·L-1Pepstatin，2 mmol·L-1PMSF），裂解30 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，BCA法蛋白定量。加入上清緩衝液，100 ℃加熱5 min。每孔上樣20 μL總蛋白，12% SDS-PAGE進行電泳，在轉移緩衝液中，以100 mA的電流轉移到PVDF膜上。PVDF膜用含5%牛奶的TBST液封閉2 h，加入大鼠抗TGF-β1單抗，4 ℃孵育過夜。繼以相匹配的辣根過氧化物酶結合的二抗室溫孵育2 h，ECL 試劑盒顯色，β-actin為內參，用圖像處理係統進行分析。