巴甫洛夫在60多年的科學研究工作中，主要研究了生理學中的三個部分——血液循環、消化和高級神經活動。他在這三部分的生理學研究中，創立了許多新的研究方法，通過這些新的方法，使他完成了許多極其可貴的科學發現，進而有力地推動了整個生理學及其相關科學的長足發展。
巴甫洛夫在研究某一科學問題時，首先總是要擬訂出詳細的研究方法。他在《關於方法在科學工作中的意義》中說：“人們常說，科學是依賴於方法的進步程度為推動而前進的，這句話不假。方法每前進一步，猶如我們每上升一階一樣，它會為我們展開更廣闊的視野，因而看到前所未有的對象。正因為如此，所以擬訂方法是我們研究的首要任務。”
他的研究之所以有顯著的成就，就是因為他運用正確合理的方法，把外科學的方法應用到生理學上來。他拋棄過去的急性試驗法（運用活體解剖的一次實驗而不采取保存動物生命的任何安全措施），采取了循序漸進的實驗法（隻破壞局部組織的實驗法，但采取保全動物生命的措施）。從而能夠係統地觀察並對完全處於常態的動物進行實驗。
巴甫洛夫的第一篇科學著作是有關胰腺活動研究的問題，寫於1874年。由於這一著作他獲得了大學的金質獎章，巴甫洛夫製訂了輝煌的方法——給動物安裝固定的胰腺瘺管。這一方法同過去完全不同，它能夠在被實驗的動物保持健康和精神振奮的狀態下係統地來觀察所取得的純胰液。
當時在科學界對胰腺的作用進行了長期的不休止的爭論。一些學者認為：當神經係統作用於胰腺時，就引起了它的動作，這樣胰腺的活動就被認為是反射性的。另一些學者認為，胰腺的活動是經過血液的化學因素影響的結果。
巴甫洛夫在其對胰腺的進一步研究中確定了：當用電刺激迷走神經時就總會分泌出胰液來。但是不久，生理學中發現了胰液素，當它進入血液之後，就可能刺激胰腺。於是巴甫洛夫最後得出了結論：胰腺的動作既為神經因素所製約，又為通過血液而起作用的化學物質所製約。
巴甫洛夫初期的科學工作主要是在鮑特金教授的指導下研究血液循環。在這裏他進行了長時間的研究，1883年寫出了《心髒的離心神經》的有名的博士論文。他在該文中得出這樣的結論：兩對彼此分立的神經調節著心髒的活動，這兩對神經相反地作用於心髒收縮律（延遲神經和加速神經）與心髒收縮力（弱化神經和強化神經）。
巴甫洛夫關於血液循環的著作成了建立現代血液循環生理學學說的基礎。巴甫洛夫把血液循環器官當做是具有自己的調節機構的自我調節係統。
在這個時期的著作中，巴甫洛夫首次提出了關於神經係統在營養有機體組織上的作用的思想。他在以後的科學活動中發揮了這一思想，結果就建立了各器官的營養性神經作用的理論。他認為，與機能神經，亦即與能引起或阻止某器官的活動的神經，以及與用血管的收縮和擴張來調節血液流通的血管神經並存的還有調節組織營養的營養性神經。
全麵地研究神經係統的各種活動，這些活動基本上保證了有機體生活機能的完整性與有機體各個器官之工作的精細的相互關係，是巴甫洛夫的整個研究的中心思想。
巴甫洛夫的科學研究的這一中心思想，即強調神經係統在一切生活活動過程中的調節作用，在生理學和醫學中被他以“神經論”這一術語標誌了出來。
1884年，巴甫洛夫獲得了講師的稱號。但直到1890年為止，他的科學研究活動始終是在極端惡劣的條件下進行的。
1890年，41歲的巴甫洛夫獲得了教授的稱號，得到了自己的實驗室，成為軍醫學院的藥物學教授（以後是生理學教授）和實驗醫學院的生理係主任。
這期間，巴甫洛夫致力於消化問題的研究。為了詳盡地研究消化係統的機能，他擬出了一些獨特而複雜的外科手術。如：切斷食道而采用胃瘺管，使胃孤立起來等。
切斷狗的食道而同時安裝其胃瘺管的手術是按下列方法進行的：首先給狗施以安裝胃瘺管的手術，使之能經瘺管來人工喂養並收集流出的胃液。然後在頸部切斷食道，被切斷的食道的兩端分別地使之生長在皮膚傷處的兩邊上，使其露到外麵來。這樣口腔就與胃腔隔離開了。這一手術就使得在任何時候都有可能對狗做“假飼”的實驗。這時動物所攝取的食物就經食道的上孔落出，而在食物剛一進入口腔時作為其反射的開始而分泌出的胃液就可以經胃瘺管任意收集。這樣就證實了神經係統在胃腺活動中的調節作用。巴甫洛夫把這些實驗當做醫療實踐，他培製了所獲得的狗的純胃液，把它用做腸胃係統疾病的藥物。
“假飼”實驗被一些學者認為是“19世紀最漂亮的實驗”。但是為了正確地研究胃液分泌的規律及其在消化時的特性，首先就必須保證胃之正常的消化。而“假飼”是不能滿足這一要求的。因此巴甫洛夫想到並著手研究新的手術，即形成所謂小胃，或孤立胃的方法。
解剖學和外科學的專家們都預言他一定失敗。他們認為：“血管性狀是與手術本身的真義相矛盾的。”但是，巴甫洛夫卻獲得了成功。
他在狗胃的下部區分出一孤立的小胃而保留其與胃及整個有機體的一切神經聯係。將小胃與大胃如此隔離開，使食物不能進入，並使它始終不受大胃的影響。當食物進入大胃之後，大、小胃腺均分泌出胃液來，而這胃液就可由被引到外邊來的孤立的小胃的開口處收集。這樣就能收集到相當純的胃液，就能夠研究胃液分泌的規律及其重要的成分了。
巴甫洛夫的這些新穎而有效的手術，已成了典型的方法納入了世界科學的寶庫之中。
作為他在消化方麵研究的重要總結——《主要消化腺工作講義》於1897年出版。本書向我們展示了巴甫洛夫研究消化方麵的主要成就：確定了消化腺（唾液腺、胃腺、腸腺、胰腺）的工作規律，發現了消化道各個部分相互作用的事實，並闡明了保證整個消化器官複雜活動的神經機構。
這本書問世後不久就被譯成歐洲各國語言，流傳於整個歐洲。各國的科學家認為：最近數十年來“就未曾有過一位研究者在歲月不算多的期間內獲得巴甫洛夫書中記載的那樣多的發現”，並給他以極高的評價。
巴甫洛夫關於消化係統工作的學說重新改造了全部的消化生理學。他在這方麵的研究於1904年獲得了諾貝爾獎金，這是對學者的最高的國際獎賞。巴甫洛夫在1907年被選為俄國科學院士。這期間的許多外國科學院和學術團體也給了巴甫洛夫各種榮譽稱號。
巴甫洛夫研究高級神經活動學說，是以伊萬·米哈依洛維奇·謝切諾夫的研究作為基礎的。謝切諾夫在1863年發表了他的不朽著作《大腦反射》，這一著作在自然科學中開辟了一個新的時代，它在俄國唯物主義發展中有著很大的意義。謝切諾夫在這一著作中發展了在當時還是新穎的、異常勇敢的思想：整個精神生活都受到以各種不同的聽覺、視覺、味覺、嗅覺及觸覺刺激的形式作用於適當的感覺器官之外的影響所製約。這些刺激則沿著向心神經以神經衝動的形式傳遞到中樞神經的各部門並引起相適應的反應。
謝切諾夫在《大腦反射》中發揮了唯物主義的基本觀點。他寫道：“人類整個活動的第一原因決定於外在事物”，“不以外在環境來維持其生存的有機體是不可能有的”，“一切有意識及無意識的生活活動按其生產方式來說都是反射。”
巴甫洛夫在研究大腦機能的實驗工作中，就是以謝切諾夫在科學上輝煌的革命思想為指南的。“謝切諾夫思想的天才昭示”成了鼓舞他研究的源泉。關於這一點，他本人曾不隻一次地寫道：“俄羅斯生理學之父伊萬·米哈依洛維奇·謝切諾夫以大腦的反射為題的名著之重大影響是引起我的決心的主要動力，雖然那時還很年輕，而且並非是有意識的。這一充滿了新穎思想和對思想現實的信心的影響，尤其在青年時代是那樣地深刻，那樣地牢不可動，而且還應該說是那樣地奧妙。在這本著作中也作了一個外表極其漂亮的實際上在當時是個非凡的嚐試，即純生理地想像我們的主觀世界。”
這樣，謝切諾夫的著作《大腦的反射》就成了巴甫洛夫關於高級神經活動學說的起點。巴甫洛夫寫道：“我把我們的研究起點歸之於1863年末，即當謝切諾夫有名的《大腦的反射》問世的時候。”
巴甫洛夫已被公認為“世界第一生理學家”，這一偉大的俄羅斯科學家多年的創作幾乎包括了自然科學最重要的部門——生理學的一切部分。而他在這一切部門都提供了作為先進科學的重要基礎的無可估價的貢獻。
然而，巴甫洛夫在科學中進行的真正的革命是他著手研究大腦兩半球生理學和動物與人的高級神經活動。他把一生的30年貢獻於高級神經活動學說的研究。
他在《大腦兩半球機能講義》的第一講中，對比地談道：“大腦兩半球活動的範圍是無限大的”，而兩半球機能生理學的內容卻是極貧弱的。他寫道：“歸之於兩半球活動的動物的一切高級的與複雜的行為……幾乎都沒觸及……而且也沒有包括在當前生理學工作的提綱中。”他斷言：隻有“對動物的大腦兩半球作生理學的、客觀的研究才是正確地分析人的主觀世界的基礎”。
1903年在馬德裏召開的國際醫學會議上，巴甫洛夫在報告中就談到：“必須完全擺脫將一己的主觀見解用來樸素地解釋實驗動物的反應機構，而應集中注意來研究外在現象與我們有機體反應的聯係。這是首要和極其重要的任務，要站在純客觀的立場上進行研究。”
當時，在研究動物大腦中的極纖細的神經過程上的主要障礙就是缺乏適當的研究方法。因為作為高度組織起來的物質的最複雜的形式的大腦神經組織，實質上不可能用那些一般的、較粗俗的方法來研究，這些方法隻能用來研究動物大腦之最一般和原始的特性。另外，在研究那些決定動物行為的大腦機能時，以往的研究者不正確地、無因由地把人的心理能力加諸動物，而竟誤認為是動物所具有的。
為了克服這些障礙，巴甫洛夫首先采取了條件反射法。
他在研究消化腺的工作中就已經確定，不僅是直接進入消化道內的食物引起消化腺液的分泌，而且食物的外形也會引起消化腺的活動。不僅如此，與接受食物的動作相聯係的各種刺激（如盛食物的碗，送食物的人的腳步聲）都同樣會激起消化腺的分泌。巴甫洛夫最初把這類分泌稱之為“心理的分泌”。他認為，這種現象顯然是與發生於動物大腦中的神經過程對消化腺活動的調節相關聯的。
實驗證明：食物直接作用於口腔粘膜就會引起唾液分泌的反應。有機體對外界刺激的這種回答性反應就是對天賦的反射。巴甫洛夫則稱之為無條件反射。同時他又用大量的實驗證明：經常與接受食物的活動同時出現的未分化的刺激物也會引起同樣的回答性反應。有機體在個體生活中所獲得的這些反應，巴甫洛夫統稱為條件反射。
這些反射之所以稱為條件反射，是因為它們隻能在具備一些適當的條件時，即作用於動物的未分化刺激物在力量上和性質上都必須是在動物的一定特殊受納器（如視覺、聽覺、味覺、嗅覺等器官）力所能及的時候；刺激物在時間上多少要先於某種無條件刺激物（食物、酸、令人疼痛的東西等）開始作用之前（5秒～30秒）；它不應同時伴有其他外界刺激物的作用。
這樣，如果有一隻饑餓的狗，先用任一種聲的、光的或其他的刺激物刺激它10秒～20秒鍾，然後再給它一份肉麥混合粉，則在重複數次這樣的程序之後，狗就會在一種單一的外界刺激物（聲或光等）的作用下開始分泌唾液。這就是在無條件食物反射基礎上養成的對聲或光分泌唾液的條件反射。
巴甫洛夫曾證明，來自動物體表麵的某一受納器（感覺器官）之神經衝動沿著向心神經而趨向中樞神經係統，然後再從中樞站沿其他的神經纖維（離心的）進入唾液腺或其他腺的分泌細胞或進入動物筋肉的個別組織內，使工作器官發揮作用，引起有機體的相應的無條件反射活動。
動物的無條件反射在沒有大腦皮質參與的時候也可能發生。如，去掉頭部的青蛙就能以適當的反射運動對貼在其背上的受酸浸過的紙有反應，用爪子抓這塊紙。當食物進到已被除去大腦高級部分——大腦兩半球皮質——的饑餓的狗的口腔時，仍會引起唾液分泌。
下列事實可以作為人與動物的無條件反射的例子：當遇到突然的光亮瞳孔收縮，在偶爾有小粒子進入氣管時為排除它而發生的咳嗽。這些無條件的，在遺傳上固定起來的反射組成了各種行為反應形式的基礎，而這種反應受地球上各種動物有機體的生活活動特點的製約。在進化發展的進程中某些種類的動物則主要的是依著無條件反應，即所謂的本能反應的方式形成了自己與環境的適應性的相互關係。
無條件反射是有機體對外界具體刺激所作的在曆史發展的進程中固定起來的一種適應性的反應。在動物大腦兩半球皮質中形成的條件反射是動物有機體對其所處的環境中之極為多種多樣的刺激的比較複雜的反應。這就是該有機體對其具體的生存條件的個體適應的反應。
高等動物條件反射的神經衝動則與無條件反射不同，因為它具備著作為其中樞站的大腦皮質。巴甫洛夫已經證明，暫時的神經聯係是在大腦皮質中形成的，即在大腦皮質中兩個神經細胞點（中心）間神經接通和連接起來。這種神經聯係的接通發生於感受著某種外界刺激（光線、聲音等）的神經“中樞”與在大腦皮質內有其代表的無條件反應的“中樞”之間。
巴甫洛夫以狗的唾液腺作為觀察大腦兩半球皮質活動的典型對象。這一對象之所以成為巴甫洛夫研究整個高級神經活動學說的典型是因為安裝唾液瘺管的手術很簡便。唾腺液（耳下腺或鄂下腺）容易分泌到狗的兩頰外麵來，當條件刺激物和無條件刺激物作用時易於用特種表格記載唾液泌出量。
根據條件反射唾液分泌量的多少或有無的事實才有可能來研討發生於大腦皮質內的整個神經過程的性質。我們已經談到過：如果任何一種聲音刺激總是隨同飼食而發生，則在經過若幹次配合之後其單獨作用就會引起狗的條件唾液分泌。根據這一唾液分泌量的多少，我們就可以研討發生於皮質細胞兩個接通組間的興奮過程的力量。
條件刺激物似乎已成為無條件刺激物的信號，從而可以看出，大腦兩半球皮質活動正表現為信號活動或條件反射活動。個別的信號刺激物的生理意義可依其作用的條件而變化：它們可以同各種無條件刺激物聯係起來，最後它們還可以改變自己的作用的性質，使個別器官的活動興奮或抑製。
大腦兩半球皮質神經中樞對外界刺激物的巨大的敏感性，使得必須把用做實驗研究的動物隔離到專用的隔音室內，以免受到突如其來的外界的影響。這樣，環繞著實驗動物的環境就是不變化的。在室外的實驗者就有可能用安在室內的各種信號刺激物作用於實驗動物。當這些刺激物與食物或其他無條件反射配合時，就能夠研究發生於實驗動物大腦兩半球皮質中的神經過程的基本規律。
巴甫洛夫認為，大腦兩半球皮質是高級的、最複雜的相互作用的器官，是動物有機體與外在周圍環境間的“均衡器官”。
為了理解組成大腦兩半球皮質活動基礎的複雜而細微的神經過程，巴甫洛夫本人和他的許多學生做了多年縝密而又頑強的工作，終於確立了皮質的神經細胞能夠處於兩種相互矛盾的狀態——興奮或抑製狀態中這一理論。統一的神經過程就是在這兩個彼此矛盾的生理狀態的鬥爭中發展起來的，它是由興奮過程和抑製過程形成的，而且在每一個一定的瞬間其中總有一個過程占優勢。整個的大腦兩半球皮質以複雜的、多層的動力鑲嵌細工的形式表現出來，而且一些神經細胞組處於興奮狀態，而另一些神經細胞組則處於抑製狀態。
每一神經細胞組或者與大腦兩半球皮質的感受裝置相聯係，或者與動物有機體的各種工作的執行器官相聯係。大腦兩半球皮質細胞的興奮就引起相應器官的積極活動，而抑製便製止這一活動。
巴甫洛夫利用條件反射法證明了：隻有那些對該動物有機體具有重大意義的，而且在時間上與無條件反射相連接的陽性刺激物，才會在若幹時間內逐漸地鞏固起來。當長期地缺乏在時間上的重複配合時，它們就會匿跡或消失。這並不是說它們對該有機體又變成無關的東西了。其痕跡在一生中或長或短的時間內仍有作用。而當其經過一定的時間後偶爾又配合起來時，它們又會重新迅速地複活起來。條件反射在大腦皮質中鞏固和消失就是我們記憶的生理基礎。
擴散現象、集中現象和相互誘導現象可歸結為大腦皮質內神經過程（無論是興奮的，還是抑製的）的基本規律。
巴甫洛夫用實驗證實：當興奮過程的集中具有一定的力量時，在它以後與在它作用的同時，它會引起抑製的出現。此時跟隨在該強化了的刺激物之後的另一條件刺激物就多少減低了條件反射的動力。這也就是負誘導現象。
巴甫洛夫條件反射的研究表明：像興奮過程一樣，神經中樞可能進入被抑製狀態所引起的相反的狀態中。這一狀態就引起相應的活動器官或分泌器官的抑製或停止。當不用某種無條件刺激物來強化而重複外界作用的刺激物時，這種狀態便會形成。