[Key words]Potentilla chinensis； asiatic acid； alcohol； hepatic injury
doi：10.4268/cjcmm20151433
委陵菜Potentilla chinensis Ser.為薔薇科委陵菜屬植物，常用於治療免疫係統疾病和肝髒疾病[1]。許多研究表明，從委陵菜中分離的積雪草酸具有抗炎[2]、抗腫瘤[3]、抗糖尿病[4]等多種藥理作用。積雪草酸可減輕高脂血症引起的金黃地鼠的肝損傷，其降脂及保肝作用可能與增強LCAT和SR-BⅠmRNA的表達有關[5]。然而，積雪草酸抑製酒精性肝損傷的作用尚未有報道。因此，本研究擬采用乙醇誘導大鼠肝損傷模型探討委陵菜積雪草酸對酒精性肝損傷大鼠的保護作用及作用機製。
1材料
丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、穀草轉氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、穀胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、穀胱甘肽還原酶（GSH-Rd）試劑盒購於南京建成生物工程研究所；白細胞介素-1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒購於武漢博士德生物工程有限公司。
委陵菜購於南寧千金子製藥有限公司，積雪草酸由廣西醫科大學藥學院分離並鑒定。雄性Wistar大鼠，SPF級，體重（180±10） g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，動物使用合格號SCXK桂2009-0002。
2方法
2.1動物分組及給藥90隻大鼠隨機分成6組，每組15隻，分別為正常對照組，AA對照組，模型組，AA低、中、高劑量治療組。除正常對照組及AA對照組外，模型組及AA低、中、高劑量組劑量遞增灌胃給予食用乙醇：1～4周5.0 g·kg-1；5～8周7.0 g·kg-1；9～12周9.0 g·kg-1；13～24周9.5 g·kg-1，每日1次。造模的同時，AA低、中、高劑量組分別灌胃給予：2，4，8 mg·kg-1AA。正常對照組、模型組給予等量生理鹽水，AA對照組灌胃給予AA 8 mg·kg-1 ，每日1次，連續24周。末次給予乙醇1.5 h後，將大鼠用鹽酸氯胺酮麻醉處死（30 mg·kg-1，iv）。肝素抗凝管（50 U·mL-1）收集血樣。解剖摘取肝組織，並立即用冰生理鹽水洗盡表麵血液。於肝左葉同一部位取小塊肝組織固定在10%福爾馬林溶液中以做組織病理學分析，其餘肝組織立即存儲於-80 ℃以供後期分析。
2.2AST和ALT活性測定按照試劑盒說明書測定ALT和AST血清水平。
2.3肝髒MPO，TNF-α和IL-1β活性測定髓過氧化物酶（MPO）活性， TNF-α和IL-1β活性采用夾心酶聯免疫吸附試驗法（ELISA法），嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2.4抗氧化酶和脂質過氧化的活性測定肝組織加入冰Tris-HCl（5 mmol·L-1的含有2 mmol LEDTA，pH 7.4）進行勻漿，勻漿後4 ℃ 1 000×g離心15 min。取上清液立即用於測定SOD，GSH-Px，GSH-Rd。脂質過氧化產物MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，肝髒MDA含量以μmol·g-1蛋白質表示。
2.5Western blot免疫檢測從肝組織中提取總蛋白，並用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行分析。取總蛋白20 μg測定Toll樣受體4（TLR4），CD14，髓樣分化因子88（MyD88），TIR結構域銜接蛋白-β（TRIF）含量。根據說明書，用NE-PER試劑提取細胞核和細胞質蛋白。取核蛋白20 μg測定NF-κB/P65亞基水平。蛋白質樣品在十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離並使用半幹轉移法轉移到聚偏氟乙烯膜中。轉移後，將膜用Tris緩衝鹽水（TBS）衝洗並用含5%脫脂奶粉的TBS室溫下封閉1 h。然後分別加入Toll樣受體4，CD14，MyD88， NF-κB/P65多克隆抗體，4 ℃孵育過夜。以β-actin為標準分別對信號進行歸一化。次日，吸棄一抗，用TBS / T（含0.1%聚氧乙烯脫水山梨醇單月桂酸酯（吐溫20）的TBS）衝洗，接著用相應的二抗室溫下孵育1 h。最後加ECL發光劑於暗室充分反應後用膠片曝光，光密度掃描檢測蛋白的表達，並使用圖像分析係統進行定量。
2.6病理檢查於肝左葉同一部位取小塊肝組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋。切片，每張切片厚度為5 μm，進行蘇木精-伊紅（H&；E）染色。觀察組織變化。
2.7統計分析應用SPSS 11.5 軟件進行統計分析。數據均以±s表示，經方差齊性檢驗，方差齊者采用t 檢驗，方差不齊者采用校正t檢驗進行統計處理，P
3結果
3.1AA對血清ALT及AST 活性的影響與正常組比較，模型組中大鼠血清ALT及AST活性升高，而AA治療後ALT及AST活性明顯降低，AA對正常大鼠ALT及AST活性幾乎沒有影響。
3.2AA對肝過氧化物酶的影響與正常組比較，模型組中大鼠MPO活性升高，而AA治療後升高的MPO活性降低至正常水平。AA對照組中MPO水平與正常組間無差異。
3.3AA對肝TNF-α及IL-1β水平的影響與正常組比較，模型組中大鼠肝TNF-α及IL-1β水平升高，AA治療後TNF-α及IL-1β明顯下降。AA對正常大鼠TNF-α及IL-1β表達幾乎沒有影響。