2 結果與分析
2.1 AsAACT的cDNA全長克隆 利用引物AACT-S/A在單鏈cDNA模板上擴增出長約800 bp特異條帶。通過BLAST程序檢索，該片段與長春花（Catharanthus roseus，Accession No. JF739870.1）、蒺藜狀苜蓿（Medicago truncatula，Accession No. XM_003637549.1）、煙草（Nicotiana tabacum，Accession No. AY748245.1）的AACT核苷酸序列同源性達到78%，77%，76%，初步確定該片段為白木香AACT基因片段。據此設計用於基因3′-RACE和5′-RACE序列擴增的特異引物，通過PCR擴增分別得到約700，400 bp的條帶各1條，最終拚接得到1條長為1 476 bp的基因序列。該序列與毛果楊（Populus trichocarpa，Accession No.XM_002308719.1）、蓖麻（Ricinus communis，Accession No. XM_002522830.1）、桐油樹（Jatropha curcas，Accession No. GAHK01010210.1）、釀酒葡萄（Vitis vinifera，Accession No. XM_003635348.1）和巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis，Accession No. AF429383.1） AACT基因全長序列的相似性分別為81%，80%，80%，79%，79%。
通過NCBI中ORF finder工具查找到該序列包含1個1 236 bp的開放閱讀框，編碼411個氨基酸。編碼序列與毛果楊（Populus trichocarpa，Accession No.XP_002308755.1）、蓖麻（Ricinus communis，Accession No. XP_002522876.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana，Accession No. NP_199583.1）、煙草（Nicotiana tabacum，Accession No. AAU95619.1）和蒺藜苜蓿（Medicago truncatula，Accession No. XP_003637597.1）AACT蛋白序列的同源性分別為86%，85%，81%，82%，84%。為了驗證拚接序列的正確性，根據拚接好的序列設計引物對白木香的AACT基因編碼區進行擴增，序列測定結果與拚接結果序列一致。由此確定該序列為白木香AACT基因的cDNA全長序列，將其命名為AsAACT （注冊號 KF498703），預測蛋白命名為AsAACT。
2.2 白木香AsAACT基因cDNA全長及預測蛋白質序列分析 AsAACT的5′端非編碼區長150 bp，3′端非編碼區長90 bp，編碼區長1 236 bp，共編碼411個氨基酸殘基。使用ExPaSy ProtParam程序預測AsAACT的相對分子質量為42.6 kDa，分子式為C1875H3030N532O565S16，理論等電點為8.36，蛋白不穩定係數為28.47，屬於穩定蛋白質。AsAACT共有20種氨基酸，其中量最高的是Gly，Ala，均為12.4%；Leu，Val，Ser 也較多，分別為9.7%，8.3%，8.3%；量最低的是Trp，隻有0.7%。用NCBI的Conserved Domains數據庫對序列進行分析，第13位點到399位點具有顯著的硫解酶特性，第9位點到402位點具有乙酰輔酶A酰基轉移酶活性。Prosite在線軟件分析顯示，AsAACT具有6種類型基序，包括21個N端酰基化位點（N-myristoylation site），2個蛋白激酶C磷酸化位點（protein kinase C phosphorylation site），1個N端糖基化位點（N-glycosylation site），1個cAMP-及cGMP-依賴的蛋白激酶磷酸化位點（cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site），6個CK II磷酸化位點（casein kinase II phosphorylation site）和1個微體C-末端的定位信號（microbodies C-terminal targeting signal）。整體蛋白具有顯著的硫解酶結構域，表明其具有轉酰基的功能。
2.3 白木香AsAACT蛋白特性分析 運用SignalP 4.1 Server 對AsAACT氨基酸序列的信號肽進行預測。第41號氨基酸殘基具有最高的原始剪切位點分值0.113，第41號氨基酸殘基具有最高的信號肽分值0.160，第37號氨基酸殘基具有最高的綜合剪切位點分值0.286。由此可見，AsAACT不存在信號肽酶切位點，不具有信號肽。
序列的跨膜結構域進行預測。結果顯示，肽鏈N端存在1個跨膜結構域。應用PSORT II軟件對蛋白定位發現，AsAACT主要存在於細胞質的內質網上，除此之外還分布於過氧化物酶體（微體）中。結合信號肽及跨膜結構域預測可知，AsAACT在細胞質中合成後，不進行跨膜運轉，靠其跨膜結構域與細胞膜脂的相互作用，AsAACT主要存在於細胞質基質中的特定部位行使催化功能。
運用Prot Scale軟件對AsAACT氨基酸序列的疏水性/親水性進行預測。結果顯示，多肽鏈179位為親水性最強的位點，分值為-2.389，多肽鏈370位疏水性最強，分值為3.000。整個多肽鏈中疏水性氨基酸隻含44.5%，蛋白表現為弱親水性。
2.4 白木香AsAACT蛋白二級結構、三級結構的預測 運用SOPMA對白木香AsAACT氨基酸序列的二維結構進行預測，白木香AsAACT由47.20%的α-螺旋，13.38%的延伸鏈，8.76%的β折疊和30.66%的不規則卷曲組成。α-螺旋是白木香AsAACT中最多的結構元件，以不規則卷曲散布於整個蛋白質中。運用CPHmodels-3.2 Server在線軟件對AsAACT氨基酸序列進行蛋白質三維結構同源性建模分析，AsAACT蛋白由N端結構域、C端結構域及蛋白活性中心構成，可見一明顯的ββ超二級結構，結構疏鬆，即為蛋白的活性部位。
2.5 於胞質中參與萜類代謝的AACT和擬南芥的2個同源的AACT氨基酸序列進行比對分析。可以看出，AsAACT蛋白的功能域與其他植物AACT蛋白的功能域有著比較一致的氨基酸組成，隻是在N端與C端蛋白變異較大；AsAACT蛋白與擬南芥AACT1酶的長度比較接近。
利用MEGA5軟件中Clustal W法對白木香AsAACT及擬南芥2個同源AACT蛋白進行比對，同時對包括白木香在內的12種植物的同源AACT蛋白序列比對，並用Neighbor-joining法構建了係統進化樹。進化樹分為兩大支，上麵一支均為雙子葉植物，下麵一支均為單子葉植物；上麵一大支可分成兩小支，一支分布著擬南芥AACT1和其他物種的AACT2，白木香AsAACT也分布在這支上，另一支則分布著擬南芥AACT2和大部分物種的AACT1及少部分物種（可可樹及野草莓變種）的AACT2。
2.6 AsAACT在傷害處理後不同時間表達分析 實時熒光定量PCR結果顯示AsAACT在正常白木香愈傷組織中表達量較低，采用MeJA處理後表達水平短時間內顯著升高，在4 h處基因表達量最高，是對照組的5.48倍，但很快恢複原來水平；而切割處理後AsAACT表達量基本沒有變化。結果說明化學傷害（MeJA處理）可誘導AsAACT的表達，且主要在早期響應傷害脅迫，而後期則基本恢複原表達水平。
3 討論
前期，已獲得白木香MVA途經的HMGS與HMGR基因全長[8-9]。本研究首次從白木香的莖組織中克隆獲得了MVA途經第1個關鍵酶AACT基因的第1個同源基因，這也是沉香屬植物第一次獲得該基因全長。生物信息學分析表明，該基因編碼的氨基酸具有典型的AACT酶的作用位點、模序及結構域，這些結構是AACT同源蛋白行使功能時不可缺少的組成單位，因此說明克隆得到的AsAACT基因是高等植物硫解酶基因家族的新成員。
Arabidopsis thaliana- NP_199583.1，NP_851150.1，NP_568694.2，NP_851154.1. 擬南芥；Brachypodium distachyon-XP_003565785.1. 二穗短柄草；Cicer arietinum-XP_004491615.1.XP_004507588.1. 鷹嘴豆；Cucumis sativus-XP_004144550.1.XP_004139514.1. 黃瓜； Fragaria vesca subsp. vesca-XP_004303573，XP_004293407.1.野草莓變種；Glycine max-XP_003551110.1，XP_003529679.1，XP_003551110.1.大豆；Salvia miltiorrhiza-AEZ55671.1.丹參； Solanum lycopersicum-XP_004236650.1，XP_004239258.1.番茄； Theobroma cacao- EOX93535.1，EOX93536.1.可可樹；Triticum uratu-EMS66391.1.烏拉圖小麥；Vitis vinifera-XP_003635396.1. 葡萄；Zea mays-ACG34735.1.NP_001266315.1，NP_001141874.1.玉米；AsAACT-Aquilaria sinensis.白木香；箭頭所指為白木香AACT基因的預測蛋白；A.與擬南芥比對圖；B.與其他已克隆出同源基因的物種進行比對。
熒光定量PCR結果表明該基因表達對MeJA誘導的化學傷害較為敏感，且主要在早期響應傷害脅迫，後期則基本恢複原表達水平，而該基因表達對機械切割造成的物理傷害基本沒有反應，可能是由於愈傷組織本身比較鬆散，切割並不能顯著破壞細胞結構，因而沒有顯著反應，同時也在一定程度上說明AsAACT基因對化學傷害反應強於物理傷害，但持續時間較短，屬於防禦反應早期應答的基因。
本研究的開展為從分子水平上調控AsAACT基因表達量及提高白木香萜類成分含量提供了基礎數據。當然，AsAACT基因究竟在沉香的形成過程中起著怎樣的作用，白木香中AACT的其他同源基因與其功能具有怎樣的差異，其與通路的其他酶基因如何相互配合共同調控萜類代謝途徑還有待進一步的研究。另外物理傷害和化學傷害對基因誘導表達的差異是否存在、如何表現及機製如何也值得探索。
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