白木香乙酰乙酰基輔酶A硫解酶基因（AsAACT）的克隆與表達分析
資源與鑒定
作者：劉娟 徐豔紅 楊勇 梁良 韓曉敏 高誌暉 張爭 楊雲 魏建和
[摘要] 目的：對國產沉香的基原植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg乙酰輔酶A酰基轉移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase，AACT）基因AsAACT全長進行克隆並展開生物信息學分析和表達分析，為解析沉香萜類次生代謝產物的生物合成機製奠定基礎。方法：根據獲得的白木香轉錄組數據庫AACT部分轉錄本序列設計引物，采用RT-PCR及RACE技術，以白木香莖cDNA為模板，克隆獲得AsAACT全長，進行生物信息學分析；采用熒光定量PCR，以GADPH為內參，分析白木香愈傷組織受不同傷害脅迫AsAACT的表達模式。結果：AsAACT開放閱讀框（opening reading frame，ORF）為1 236 bp，編碼411個氨基酸殘基，酶命名為AsAACT；白木香愈傷受物理傷害（切割）後表達量沒有明顯變化，但受化學傷害（MeJA）後4 h表達量升高了5.5倍，說明該基因對MeJA誘導的化學傷害較敏感，且能夠在早期響應傷害脅迫。結論：通過AsAACT基因的全長cDNA克隆和表達特性分析，為後續深入研究其在沉香倍半萜合成途徑的功能奠定基礎。
[關鍵詞]白木香；AACT基因；MVA途徑；序列分析；表達分析
國產沉香為瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg含樹脂的木材，其性微溫，味辛、苦，歸脾、胃、腎經，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘的功效[1]。沉香藥效成分主要為倍半萜類化合物和色酮類化合物[2-5]。倍半萜類化合物由存在於胞質的甲羥戊酸 （mevalonic acid pathway，MVA）途徑和質體的脫氧木酮糖-5-磷酸（1-deoxy-D-xylulose- 5-phosphate pathway，DXP）途徑合成。研究表明，MVA途徑是倍半萜生物合成中C5單位IPP和DMAPP的重要來源[6-8]。目前包括白木香在內的沉香屬植物MVA途徑中僅HMGS，HMGR有研究[8-9]，其他基因的研究尚未見報道。
乙酰輔酶A酰基轉移酶（acetyl-CoA C-acetyl transferase.AACT）是MVA途徑上的第1個關鍵酶，屬於硫解酶（thiolase）家族的一員[10-13]。硫解酶（thiolase）包括2個亞型，I型硫解酶KATs（3-ketoacyl CoA thiolases）和II型硫解酶AACTs（acetyl-CoA C-acetyl transferases）[14]。I型硫解酶位於線粒體，主要作用於脂肪酸分解代謝中的β-氧化的最後一步，從脂肪酸的β-碳位上硫解下含2個碳原子的乙酰CoA和比原來少2個碳原子的脂酰CoA[15]；而Ⅱ型硫解酶主要位於胞質基質中，使兩分子乙酰輔酶縮合為乙酰乙酰CoA，而乙酰乙酰CoA是植物激素及膽固醇等化合物合成的重要起始分子[16-17]，而位於MVA途徑上的AACT就屬於II型硫解酶。目前，AACT基因已從銀杏[18]、喜樹[19]、丹參[20]等植物中成功克隆。近年來，對擬南芥基因組數據進行分析發現AACT有2個同源基因，即AACT1，AACT2，對這2個基因的功能研究發現2個基因的表達部位有所差異，且AACT2較AACT1對萜類代謝影響大[16]。本文首次克隆了白木香AACT基因，並通過生物信息學分析及表達分析初步判斷其可能作用於萜類合成，為後期功能驗證、同源基因的克隆及進一Acetyl-CoA.乙酰輔酶A；AACT.乙酰乙酰基輔酶A硫解酶；acetoacetyl-CoA.乙酰乙酰輔酶A；HMGS.羥甲基戊二酰輔酶A合酶；HMG-CoA.3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A；HMGR.羥甲基戊二酰輔酶A還原酶；MVA.甲羥戊酸；MVK.MVA激酶；MVP.甲羥戊酸-5-磷酸；PMK.二氧磷基MVA激酶；MVPP.甲羥戊酸-5-二磷酸；MDC.MVA焦磷酸脫羧酶；IPP.異戊二烯焦磷酸；DMAPP.二甲丙烯焦磷酸；IDI.IPP異構酶；FPS.FPP合酶；FPP.法呢基焦磷酸；TPSs.萜類合酶；（框內為MVA途徑）。
1 材料和方法
1.1 植物 白木香莖於2013年2月下旬采自中國醫學科學院藥用植物研究所溫室，經魏建和研究員鑒定為白木香A. sinensis，清洗幹淨後立即用液氮冷凍，存於-80 ℃冰箱備用。
EASYspin Plus Plant RNA Kit購於北京艾德萊生物科技有限公司；M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，pMD19-T載體，LA Taq Polymerase，DH 5α感受態，SYBR Premix Ex Taq均購於大連寶生物公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購於北京博邁德生物技術有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。基因測序由上海英濰捷基貿易有限公司完成。
PTC-200型PCR擴增儀（Bio-Rad），NanoDrop 2000核酸/蛋白定量儀（Thermo），台式高速離心機（Eppendorf），凝膠成像係統（Bio-Rad），製冰機（Sanyo），超低溫冰箱（Sanyo），高壓蒸汽滅菌鍋（Sanyo）。
1.2 總RNA提取與單鏈cDNA的合成 取莖樣品液氮中研磨，根據EASYspin Plus Plant RNA Kit說明書提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，用核酸/蛋白定量儀對RNA定量。cDNA合成按M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit說明書進行，合成的cDNA作為下遊反應模板。
1.3 AACT核心片段的擴增 根據白木香轉錄組高通量測序結果（羅氏公司應用RNA測序平台454 GS FLX Titanium完成cDNA文庫測序），由一段已知的AACT unigene序列（Cluster58172.seq.Contig1）設計一對引物AACT-S. 5′-CGACTTATTTCTCTGCTGCTTT-3′，AACT-A. 5′- TGCTGCTGCTCCATCACT -3′，用於AACT核心片段擴增；反應條件為0.2 mL的PCR管中加入0.5 μL的TaKaRa LA Taq （5 U·μL-1），5 μL的10×LA PCR緩衝液（Mg2+ Plus），8 μL 的dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）、引物AACT-S （20 μmol·L-1）和AACT-A（20 μmol·L-1）各1.0 μL，2.5 μL的cDNA，ddH2O加至50 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（35 個循環），72 ℃ 10 min。
1.4 3′RACE擴增 根據已克隆到的AACT核心片段，結合《分子克隆實驗指南》[21]中3′RACE錨定引物序列3′primer：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′，3′Nested primer：5′-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′，設計適合於3′RACE巢式PCR擴增的特異引物3P1：5′-GTGGATGGGATGCTCAAAGATG-3′，3P2：5′-GATCCGTTACTGCTGGCAAT GCTT-3′。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min（35個循環），72 ℃ 10 min。
根據已克隆到的AACT核心片段，結合《分子克隆實驗指南》[21]中5′RACE錨定引物序列UPM Mix（UMP-L：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA ACGCAGA GT-3′，UMP-S：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′以1∶5混合），NUP ：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，設計適合於5′RACE巢式PCR擴增的特異引物5P1：5′-GAATCCTGCTCATCTCGTCCTATT-3′，5P2：5′-CACCAGCCACGACAACATCATT-3′。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min（35個循環）；72 ℃ 10 min。
1.5 白木香AACT基因編碼區PCR擴增 根據獲得的AACT基因3′端序列、5′端序列和中間保守區序列拚接結果設計引物：ORF-S 5′-GCGTCAGCTAATACTCCAACTTCT-3′；ORF-A 5′-TTGTAAATAGGGAATGCCGAATGC-3′。在0.2 mL的PCR管中加入0.5 μL的TaKaRa LA Taq （5 U·μL-1），5 μL的10×LA PCR緩衝液（Mg2+ Plus），8 μL 的dNTP Mixture（各2.5 mmol·L-1）、引物ORF-S（20 μmol·L-1）和ORF-A（20 μmol·L-1）各1.0 μL，2.5 μL的cDNA，ddH2O加至50 μL，進行PCR 反應。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃ 3 min（40個循環）；72 ℃ 10 min。
1.6 PCR反應純化及克隆測序 按瓊脂糖凝膠回收試劑盒（博邁德公司）回收目的片段，連接到pMD19T載體（Takara公司），轉化DH5α感受態細胞，加入不含抗生素的LB培養基振蕩培養45 min，使菌體複蘇，吸取100 μL已轉化的感受態細胞，均勻塗布於含有100 mg·L-1氨苄青黴素的LB固體培養基上，37 ℃恒溫過夜培養，挑取白斑單菌落，接種於含有100 mg·L-1氨苄青黴素的LB液體培養基中，37 ℃ 320 r·min-1振蕩培養10 h。菌液PCR鑒定為陽性克隆的樣品送往上海生工測序。
1.7 白木香AACT基因cDNA序列的生物信息學分析 采用生物信息學方法對白木香AACT核苷酸及氨基酸序列進行分析，並對其信號肽、跨膜拓撲結構域、疏水性/親水性、蛋白二級和三級結構等進行預測和推斷。利用NCBI BLAST程序對核酸及氨基酸序列進行相似性檢索，用ORF Finder程序查找基因AACT開放閱讀框架；用DNAStar和DNAMAN軟件對序列進行分析比對；蛋白質信號胎的預測、跨膜結構及親水性/疏水性的分析，利用在線工具Signa IP，TMHMM，Prot Scale完成；蛋白質二級結構、三級結構的預測，利用SOPMA和CPHmodels-3.2 Server在線工具完成。
1.8 白木香AsAACT基因的表達分析 白木香的愈傷組織用解剖刀切割作為物理傷害方法，用100 μmol·L-1的茉莉酸甲酯（MeJA）噴灑處理作為化學傷害方法，利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR，qRT-PCR）的方法檢測AsAACT基因在不同傷害處理時間（0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，2 d）的表達情況。選取白木香的GADPH作為內參基因[22]，設計引物序列。實時熒光PCR反應體係為12.5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下遊引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA模板（50 mg·L-1） 2 μL，加水補足至25 μL，每個反應體係至少重複3次。擴增程序如下：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s（每次循環後采集熒光信號），40個循環；95 ℃變性10 s，65～95 ℃做熔解曲線分析，每個溫度以每步0.5 ℃上升，停留5 s，獲得白木香AsAACT基因的相對表達量。