番石榴葉乙醇提取物的化學成分研究
化學
作者：邵萌 王英 翦雨青 孫學剛 黃曉君 張曉琦 葉文才
[摘要]采用多種色譜手段，對番石榴葉95%乙醇提取物的化學成分進行分離和純化，並根據理化性質和光譜數據進行結構鑒定。從番石榴葉中分離得到18個化合物，分別為（+）-globulol（1）， clovane-2β，9α-diol（2）， 2β-acetoxyclovan-9α-ol（3），（+）-caryolane-1，9β-diol（4）， ent-T-muurolol（5）， clov-2-ene-9α-ol（6）， 異植物醇（7）， 檉柳黃素（8）， 棉花素（9）， 槲皮素（10）， 山柰酚（11）， guajaverin（12）， avicularin（13）， chrysin 6-C-glucoside（14）， 3′-O-methyl-3， 4-methylenedioxyellagic acid 4′-O-β-D-glucopyranoside（15）， 對羥基苯甲酸（16）， guavinoside A（17）和guavinoside B（18）。化合物2～9， 14～16為首次從該植物中分離得到。體外抗腫瘤活性篩選表明，番石榴葉95%乙醇提取物在60 mg·L-1下對SW480細胞的抑製率達到61.3%。
[關鍵詞]番石榴葉； 倍半萜； 二萜； 黃酮； 酚酸； 抗腫瘤
番石榴為桃金娘科Myrtaceae番石榴屬Psidium的多年生木本植物，廣泛分布於南美洲、非洲和亞洲的熱帶及亞熱帶地區[1]。番石榴葉作為民間傳統草藥，具有生津止渴、收斂止瀉等功用，多用於治療糖尿病、痢疾等疾病[2-3]。近年來有文獻報道番石榴葉提取物表現出一定的抗腫瘤活性[4-5]。為進一步探索番石榴葉的藥效作用物質基礎，為其資源開發及品質評價提供科學依據，本實驗對番石榴葉進行了較為係統的化學成分研究。從番石榴葉的95%乙醇提取物的石油醚部位和正丁醇部位中分離並鑒定了18個單體化合物，其中化合物2～9， 14～16為首次從該植物中分離得到。此外，對化合物12～15，17，18以及番石榴葉的95%乙醇提取物（Fr.A）進行了體外抑製人結腸癌細胞SW480實驗，結果表明，當濃度為60 mg·L-1時，Fr.A表現出較強的抑製細胞增殖活性，抑製率為61.3%，各被測單體化合物僅表現出微弱的抑製活性。
1 材料
X-5型顯微熔點測定儀（溫度計未校正），Bruker AV-400型核磁共振儀，Finnigan LCQ Advantage MAX型質譜儀，Dionex分析型高效液相色譜儀，Varian製備型高效液相色譜儀。柱色譜用矽膠（60～100目和200～300目，青島海洋化工廠），矽膠GF254薄層預製板（煙台化學工業研究所），D101型大孔吸附樹脂（天津海光化工公司），ODS柱色譜材料（Merck公司），Sephadex LH-20柱色譜材料（Pharmacia），其他所用試劑為分析純或色譜純。
結腸癌SW480 細胞株由本實驗室保存，RPMI 1640 培養基（美國Gibco公司），胎牛血清，磷酸鹽緩衝液（PBS，美國Hyclone公司），甲基耦氮唑藍（MTT）、DMSO、胰蛋白酶（美國Sigma公司），全自動CO2孵箱（美國杜邦公司Napoc6100），450型酶標儀（美國BioRadgs公司），YZ-1450 型層流超淨工作台（蘇州淨化設備公司）。
實驗用藥材於2007年10月采自廣東省從化市，經廣東藥學院李書淵教授鑒定為番石榴P.guajava的葉，標本（No.2007101801）保存於暨南大學中藥及天然藥物研究所。
2 提取與分離
番石榴葉藥材20.0 kg，粉碎後過60目篩，95%乙醇室溫滲漉提取3次，合並提取液，過濾，減壓濃縮得浸膏約1 500 g。浸膏加適量水混懸，依次用石油醚、氯仿和正丁醇萃取，萃取液分別減壓濃縮，得石油醚部位（300 g），氯仿部位（500 g），正丁醇部位（300 g），其餘為水部位。石油醚部位經矽膠（200～300目）柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯（100∶0～1∶1）梯度洗脫，得到12個流分（Fr.p1～Fr.p12）。Fr.p4（7 g）經矽膠色譜柱，石油醚-乙酸乙酯（100∶0～100∶10）洗脫，得到7個亞流分（Fr.p4a～Fr.p4g），Fr.p4c（2 g）經矽膠色譜柱，石油醚-乙酸乙酯（100∶0～100∶5）洗脫，得到化合物1（3 mg），3（4 mg）和7（5 mg）。Fr.p6（7 g）經矽膠色譜柱，石油醚-乙酸乙酯（100∶5～100∶10）洗脫，重結晶後得到化合物2（25 mg），4（9 mg）和6（2 mg）。Fr.p7經矽膠色譜柱，以石油醚-乙酸乙酯（100∶15）為洗脫劑，經重結晶得化合物5（3 mg）。正丁醇部位經D101型大孔樹脂， 水～95%乙醇梯度洗脫，得6個流分（Fr.b1～Fr.b6）。Fr.b5經矽膠柱色譜，氯仿-甲醇（100∶10～2∶1）梯度洗脫，得Fr.b5a～Fr.b5e共5個亞流分。Fr.b5a過ODS色譜柱，70%甲醇洗脫，再經Sephadex LH-20（氯仿-甲醇 1∶1）純化，得到化合物8（11 mg），9（8 mg），10（230 mg），11（20 mg）和16（12 mg）。Fr.b5c過ODS色譜柱，50%甲醇洗脫，經Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）純化，得到化合物12（23 mg），13（15 mg）和14（8 mg）；Fr.b3經Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1∶1）分離和純化，得到化合物17（12 mg）和18（8 mg）。
3 結構鑒定
化合物1 無色油狀物；[α]20D+27.8（c 0.05，CHCl3）； ESI-MS m/z 245 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.87（1H，dd，J=17.6，8.4 Hz，H-1），1.41（1H，m，H-2a），1.72（1H，m，H-2b），1.24（1H，m，H-3a），1.63（1H，m，H-3b），1.98（1H，m，H-4），1.19（1H，m，H-5），0.50（1H，dd，J=19.6，9.2 Hz，H-6），0.56（1H，m，H-7），0.81（1H，m，H-8a），1.77（1H，m，H-8b），1.51（1H，m，H-9a），1.69（1H，m，H-9b），0.95（3H，s，H-12），0.98（3H，s，H-13），1.07（3H，s，H-14），0.88（3H，d，J=6.8 Hz，H-15）； 13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：57.0（C-1），26.1（C-2），34.5（C-3），36.3（C-4），39.6（C-5），28.3（C-6），26.7（C-7），19.3（C-8），44.5（C-9），75.1（C-10），20.1（C-11），28.6（C-12），15.7（C-13），20.1（C-14），16.0（C-15）。上述數據與文獻[6]報道一致，化合物1鑒定為（+）-globulol。
化合物2 無色針晶（甲醇）；mp 152～153 ℃； ESI-MS m/z 261 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：3.79（1H，dd，J=10.0，5.6 Hz，H-2），1.52（1H，dd，J=12.0，10.0 Hz，H-3a），1.72（1H，dd，J=12.0，5.6 Hz，H-3b），1.42（1H，m，H-5），1.35（2H，m，H-6），1.15（1H，m，H-7a），1.44（1H，m，H-7b），3.33（1H，br s，H-9），1.68（1H，m，H-10a），2.00（1H，m，H-10b），1.10（1H，m，H-11a），1.70（1H，m，H-11b），0.92（1H，d，J=12.0 Hz，H-12a），1.54（1H，d，J=12.8 Hz，H-12b），0.86（3H，s，H-13），1.04（3H，s，H-14），0.96（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：44.4（C-1），81.1（C-2），47.7（C-3），37.3（C-4），50.6（C-5），20.8（C-6），33.3（C-7），34.9（C-8），75.3（C-9），26.2（C-10），26.5（C-11），35.7（C-12），25.6（C-13），31.6（C-14），28.5（C-15）。上述數據與文獻[7]報道一致，化合物2鑒定為clovane-2β，9α-diol。
化合物3 無色針晶（甲醇）；mp 132～133 ℃；ESI-MS m/z 303[M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：4.84（1H，dd，J=8.8，5.6 Hz，H-2），1.53（1H，m，H-3a），1.74（1H，dd，J=12.4，5.4 Hz，H-3b），1.45（1H，m，H-5），1.29（1H，m，H-6a），1.42（1H，m，H-6b），1.11（1H，m，H-7a），1.35（1H，m，H-7b），3.32（1H，br s，H-9），1.58（1H，m，H-10a），1.91（1H，m，H-10b），1.15（1H，m，H-11a），1.57（1H，m，H-11b），0.95（1H，m，H-12a），1.47（1H，m，H-12b），0.90（3H，s，H-13），1.04（3H，s，H-14），0.86（3H，s，H-15），2.04（3H，s，-OCOCH3）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：44.4（C-1），82.1（C-2），44.4（C-3），38.0（C-4），50.3（C-5），20.8（C-6），33.1（C-7），34.6（C-8），74.9（C-9），25.3（C-10），27.3（C-11），35.4（C-12），26.3（C-13），31.4（C-14），28.2（C-15），171.1（C-16），21.3（C-17）。上述數據與文獻[7]報道一致，化合物3鑒定為2β-acetoxyclovan-9α-ol。
化合物4 無色針晶（甲醇）；mp 74～75 ℃，[α]20D +11.3（c 0.05，CHCl3）；ESI-MS m/z 261[M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：2.16（1H，dd，J=19.6，10.4 Hz，H-2），1.44（2H，m，H-3），1.83（1H，m，H-5），1.35（1H，m，H-6a），1.48（1H，m，H-6b），1.10（1H，m，H-7a），1.35（1H，m，H-7b），3.46（1H，t，J=2.4 Hz，H-9），1.73（1H，m，H-10a），1.99（1H，m，H-10b），1.41（1H，m，H-11a），1.59（1H，m，H-11b），1.45（2H，m，H-12），0.94（3H，s，H-13），0.96（3H，s，H-14），0.87（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：70.9（C-1），38.3（C-2），34.2（C-3），35.2（C-4），44.1（C-5），20.6（C-6），35.6（C-7），39.5（C-8），72.4（C-9），28.4（C-10），33.6（C-11），42.7（C-12），21.0（C-13），30.7（C-14），26.8（C-15）。上述數據與文獻[7]報道一致，化合物4鑒定為（+）-caryolane-1，9β-diol。
化合物5 無色油狀物；ESI-MS m/z 245 [M+Na]+。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ：1.47（1H，m，H-1），1.50（2H，m，H-2），1.94（2H，m，H-3），5.46（1H，d，J=1.5 Hz，H-5），1.98（1H，m，H-6），1.20（1H，m，H-7），1.44（1H，m，H-8），1.50（2H，m，H-9），2.00（1H，m，H-11），0.83（3H，d，J=6.8 Hz，H-12），0.86（3H，d，J=6.8 Hz，H-13），1.25（3H，s，H-14），1.61（3H，s，H-15）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ：45.6（C-1），21.6（C-2），31.1（C-3），134.4（C-4），124.6（C-5），36.8（C-6），44.1（C-7），18.5（C-8），35.4（C-9），72.5（C-10），26.4（C-11），15.3（C-12），21.7（C-13），28.0（C-14），23.6（C-15）。上述數據與文獻[8]報道一致，化合物5鑒定為ent-T-muurolol。