1.7目的蛋白的酶活檢測
采用Bradford法進行蛋白含量的測定，采用黃嘌呤氧化酶法測定目的蛋白的活力。
2結果
2.1人參Cu/Zn-SOD基因的克隆及測序
人參葉總RNA經電泳檢測，條帶清晰明亮，無降解。RT-PCR擴增結果，電泳結果顯示，在約464 bp處出現與預期大小一致的單一條帶。測序結果與NCBI上公布的高麗參Cu/Zn-SOD對比，其同源性為99%。目的基因與質粒pET-28（a）連接成功後，經NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，電泳結果顯示，在約5 225，464 bp處出現預期大小的2條帶，說明載體構建成功。目的基因的基因編碼氨基酸序列，經DNAMAN程序進行氨基酸翻譯，共有154個氨基酸。經網絡程序預測，154個氨基酸相對分子質量為15.46 kDa，加上組氨酸標簽翻譯的氨基酸相對分子質量0.84 kDa，目的蛋白的相對分子質量為16.30 kDa。
2.2人參Cu/Zn-SOD的表達及純化
含有重組子的菌株接種到LB液體培養基後，在培養3 h時達到其對數生長期，此時進行IPTG誘導表達，當誘導表達至4 h時達到最大表達量。其電泳圖經凝膠圖像分析係統分析，表達量約為44.42%。誘導後的菌體沉澱進行破壁處理得到包涵體沉澱，使用TritonX-100洗滌3次時效果較好，使用2 mol·L-1尿素溶液複性時包涵體沉澱的溶解性較好。處理好的樣品與鎳離子親和色譜柱結合，選用20 mmol·L-1咪唑濃度為最佳洗脫濃度，純化後的目的蛋白經電泳檢測呈單一條帶。
1. 對照菌誘導0.5 h；2. 重組菌誘導0.5 h；3. 對照菌誘導1 h；4. 重組菌誘導1 h；5. 對照菌誘導2 h；6. 重組菌誘導2 h；7. 對照菌誘導3 h；8. 重組菌誘導3 h； 9. 對照菌誘導4 h；10. 重組菌誘導4 h；11. 對照菌誘導5 h；12. 重組菌誘導5 h；M. Maker（自上而下依次為97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa）。
Fig.4 SDS-PAGE elecrophoretogram of strains induced at different time
M. Maker（自上而下依次為97.2，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa）；1. 粗酶液；2. 流穿；3. 目的蛋白。
Fig.5 SDS-PAGE elecrophoretogram of purified Cu/Zn-SOD
2.3人參Cu/Zn-SOD的酶活
純化後的目的蛋白經Bradford法測定其蛋白含量，以牛血清白蛋白為標準品，繪製標準曲線，回歸方程為Y = 0.138 6X + 0.021 6，相關係數r= 0.992 1。經黃嘌呤氧化酶法測定目的蛋白的酶活為10 596.69 U·mg-1。
3討論
本研究選用的pET-28（a）載體是高效原核表達載體，具有T7啟動子，在沒有誘導劑存在時，由lacI的基因產物（阻遏物）與操縱區lacO結合，阻止基因的轉錄，目的蛋白不表達，而加入誘導劑後，阻遏物離開操縱區，質粒上受T7啟動子控製的含目的蛋白基因的DNA被轉錄，目的蛋白開始表達[11]。根據pET-28（a）載體的多克隆酶切位點區，選取NcoⅠ和XhoⅠ作為酶切位點，設計特異引物，並保留其組氨酸標簽序列，便於目的蛋白的純化。
原核表達體係在高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞內聚集形成包涵體。本研究中，包涵體采用溶菌酶方法進行破菌處理，取得了較好效果，包涵體經離心沉澱後使用Triton X-100洗滌，去除了破菌後殘留的膜蛋白。由於包涵體中的蛋白大部分都失去了天然的空間結構，分子緊密積聚成顆粒狀，其溶解性很差，本文通過實驗驗證，使用2 mol·L-1尿素可以很好的溶解包涵體，少量的變性劑經短暫透析即可除去，使表達蛋白恢複到三維空間結構，便於下一步的純化及活性檢測。
固相金屬親和色譜是近20年發展起來的一項新型分離技術，目前已逐漸成為分離純化蛋白質等生物工程產品最有效的技術之一[12]。本研究選擇鎳離子親和色譜純化目的蛋白，具有特異性好、化學和物理穩定性好、批次重複性好等特點。
本文成功構建了人參pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表達載體，並且表達量高，純化工藝簡便，便於大量生產，為進一步研究人參Cu/Zn-SOD生物學功能奠定了基礎，同時為有效利用人參資源提供一條新的途徑和思路。
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