人參銅鋅超氧化物歧化酶原核表達載體的構建、表達及純化
資源與鑒定
作者：林紅梅 王澤玉 邵玥 秦曉曄 劉詩超 張鑫 楊利民
[摘要] 研究提取人參葉中的總RNA，采用RT-PCR擴增人參葉Cu/Zn-SOD基因，構建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表達載體。使用Escherichia coli BL21（DE3）感受態細胞進行IPTG誘導表達。利用鎳離子親和層析進行純化，並采用黃嘌呤氧化酶法測定目的蛋白的酶活。經RT-PCR擴增的人參Cu/Zn-SOD基因序列與GenBank數據庫中公布的高麗參Cu/Zn-SOD基因序列同源性為99.00%。經IPTG誘導，目的蛋白的表達量約為44.42%，相對分子質量為16.30 kDa。純化後的蛋白酶活可達到10 596.69 U·mg-1。通過分子生物學方法，成功構建了人參pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表達載體，為進一步研究人參Cu/Zn-SOD生物學功能奠定了基礎。
[關鍵詞]人參；Cu/Zn-SOD；原核表達
人參為五加科Araliaceae植物人參Panax ginseng C.A.Mey的幹燥根及根莖，是我國名貴中藥。現代研究表明人參中富含皂苷、揮發油、蛋白質、糖類、脂肪酸、無機元素等多種化學成分[1-2]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）是一種能清除生物體內產生的超氧陰離子自由基（O2）的金屬蛋白酶類[3]，廣泛存在於一切生物體內。該酶具有抗氧化、抗炎、抗衰老和抗癌等多種藥理作用[4-6]。SOD根據輔基部位結合的金屬離子的不同，可分為Cu/Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD，其中Cu/Zn-SOD是平衡機體O2的主要蛋白[7-8]。以往對人參化學成分的研究大多集中於皂苷、糖類以及揮發性成分，而對人參Cu/Zn-SOD的研究報道很少。本研究從人參葉中克隆Cu/Zn-SOD基因，構建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD表達載體並誘導其表達，經鎳離子親和層析純化目的蛋白，為探索人參Cu/Zn-SOD產業化工藝流程以及進一步研究人參Cu/Zn-SOD生物學功能提供試驗依據。
1材料與方法
1.1人參
實驗用吉林人參葉采自吉林農業大學人參種植試驗田，經楊利民教授鑒定為五加科植物人參的葉。大腸杆菌Escherichia coli DH5α，E.coli BL21 （DE3），克隆質粒pMD18-T Vector，原核表達質粒pET-28（a）Vector，AMV逆轉錄試劑盒，限製性內切酶XhoⅠ，NcoⅠ，質粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒購自TaKaRa公司；TRizol Reagent購自Invitrogen公司；鎳離子親和色譜柱購自Qiagen公司。
1.2人參葉總RNA的提取[9]
將采摘的新鮮人參葉清洗後迅速放入液氮中，快速研磨成粉末。取100 mg粉末加入1 mL TRizol試劑，劇烈吹打混勻，低溫靜置5 min，加入200 μL氯仿，劇烈混勻，低溫靜置2 min，離心，吸取無色水相至另一EP管中，加入等體積異丙醇，混勻，低溫靜置10 min，沉澱RNA，離心15 min。吸去上清，沉澱用1 mL 75%乙醇洗滌，離心15 min，棄去上清，揮幹乙醇，並使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA。
1.3目的基因片段的RT-PCR擴增
1.3.1特異引物的設計根據Genbank中的高麗參Cu/Zn-SOD基因序列（AAB87572.1），設計基因片段的5′端和3′端，上遊引物為5′-CATGCCATGGATGGTGAAGGCTGTCA-3′（標記部分為NcoⅠ酶切位點），下遊引物為5′-CCCTCGAGACCCTGCAGCCCAATGA-3′（標記部分為XhoⅠ酶切位點）。委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。
1.3.2RT-PCR擴增和測序按照AMV逆轉錄試劑盒說明書進行操作，擴增目的基因。PCR參數為95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s循環30次，72 ℃ 8 min。使用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，經DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，與克隆質粒pMD18-T進行連接，構建克隆載體pMD18-T-Cu/Zn-SOD並轉化至感受態E.coli DH5α中，篩選陽性菌落，委托北京華大基因公司進行測序。
1.4重組表達載體的構建[10]
將測序正確的重組質粒pMD18-T-Cu/Zn-SOD和pET-28（a）分別進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切，將Cu/Zn-SOD與pET-28（a）進行連接，並轉化至E.coli BL21（DE3）感受態細胞中，鑒定並篩選陽性克隆菌株。
1.5目的蛋白的表達
將陽性克隆菌株和含pET-28（a）空質粒對照菌分別接種到2 mL LB（含有100 mg·g-1Kan）液體培養基裏，37 ℃恒溫，200 r·min-1過夜，次日以1∶100的比例接種到LB（含有100 mg·g-1 Kan）液體培養基裏，37 ℃恒溫，200 r·min-1培養至A600約為0.6，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG進行誘導，分別取誘導時間為0.5，1，2，3，4，5 h的菌體溶液1 mL，離心取沉澱，進行電泳檢測，優選最佳表達條件。
1.6目的蛋白的純化
將菌體沉澱用細胞裂解液和溶解酶進行破碎，得到包涵體沉澱，用TritonX-100進行洗滌，使用不同濃度（濃度為0.5，1，2，5 mol·L-1）的尿素溶液進行複性，優選最佳濃度，經透析除鹽，凍幹。凍幹樣品溶液與鎳離子色譜柱結合，使用咪唑溶液進行洗脫，分別收集每個洗脫峰，並進行SDS-PAGE電泳檢測，確定最佳洗脫條件。