誘導培養條件顯著改變甘草愈傷組織次生代謝產物的多樣性
資源與鑒定
作者：劉鳳彩 呂建明 吳秀禎 張衛
[摘要] 采用化學分析和高效液相色譜（HPLC）相結合的方法評價典型愈傷組織誘導培養條件對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性的影響，這些誘導培養條件包括甘草種屬（脹果甘草和光果甘草）、外植體（胚軸和子葉）、光照條件（24 h 光照和24 h黑暗）和2種激素組合。以化學成分總黃酮為指標，采用單因素方差分析法（One-way ANOVA）評價不同誘導培養條件下獲得的甘草愈傷組織的總黃酮含量，結果顯示甘草種屬、外植體和光照條件對甘草愈傷組織中總黃酮的含量影響顯著（P[1-5]，未見關於不同誘導條件對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性影響的報道。盡管誘導培養獲得的細胞與野生或人工種植的甘草藥材含有相似的活性次生代謝產物，但是如果它們的次生代謝產物有顯著差異，它們的藥用價值是不相同的。同時，作為一個培養生產中藥植物藥用成分或組分的技術，合適的細胞株係建立和選擇與其次生代謝產物多樣性密切相關。因此，本實驗旨在利用一種簡單快速的方法來評價不同誘導培養條件對甘草愈傷組織次生代謝產物多樣性的影響，具體來說是結合對愈傷組織的總黃酮化學分析和HPLC指紋圖譜分析來定性定量評估不同誘導培養條件下甘草愈傷組織的次生代謝產物多樣性的差異以及甘草愈傷組織與道地種植的甘草藥材的差異，從而為高產藥用次生代謝產物以及植物細胞作為替代藥材的甘草細胞株係的篩選提供實驗依據。
1材料與方法
1.1樣品甘草種子和三年生甘草根均購自新疆神農有限公司，經天津中醫藥大學李天祥教授鑒定為脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.，GI）和光果甘草（G. glabra L.，GG）；乙腈（NO.，SK Chemicals，Korea）和冰乙酸（天津光複精細化工研究所）均為色譜級；實驗中所用到的其他的化學品除有特別說明外，均為分析級藥品。
1.2種子萌發挑選充實飽滿的脹果甘草和光果甘草種子，用玻璃砂研磨去除表麵蠟質種皮，自來水衝洗7～10遍，用75%的乙醇消毒20 s後，用無菌水衝洗5～7遍，接著用3.68 mmol·L-1HgCl2溶液消毒7～8 min，再用無菌水衝洗7～10遍，用無菌濾紙吸幹種子表麵水分後接種到MS0（不添加激素）瓊脂培養基上[6]，置於黑暗條件下，25 ℃培養。3 d後，種子萌發出新鮮的嫩芽。
1.3愈傷組織誘導和繼代胚軸和子葉是文獻中最常用的甘草愈傷組織誘導的2種外植體，成功率較高[1-2，7]。本研究選擇這2種外植體進行研究，將萌發11 d後的無菌苗胚軸切成約0.5 cm的小段，子葉切成約0.5 cm2的小塊接種到誘導培養基上（MS基本培養基+激素+質量分數為3%的蔗糖+質量分數為0.7%的瓊脂），pH 5.8。根據文獻選擇的其他典型的愈傷組織誘導的激素組成和光照條件[2，5，8]。25 ℃培養，8 d後，進行第1次繼代，繼代的愈傷組織的培養條件和培養基組成與愈傷組織誘導相同，繼代周期為21 d[9]。
1.4愈傷組織分析樣品的製備不同誘導條件下獲得的甘草愈傷組織連續繼代4次，生長穩定後，取培養1個周期的愈傷組織，45 ℃幹燥至恒重，然後將愈傷組織研磨成粉末，取0.2 g甘草愈傷組織粉末加入10 mL 70%乙醇，室溫下放置24 h，超聲提取30 min，放冷至室溫，補足溶液到刻度，取上清過0.45 μm濾膜備用。
1.5總黃酮含量的測定準確量取2 mL樣品溶液，加入0.5 mL質量分數為10%KOH，渦旋混勻，室溫下放置5 min，加 70%乙醇到10 mL，渦旋混勻，室溫下放置90 min，以 70%乙醇為空白對照，在400 nm波長下測定樣品吸光度，以甘草苷為對照品繪製標準曲線。
1.6HPLC色譜分析條件 Agilent 1100高效液相色譜儀（配有G1314A紫外檢測器、G1311四元梯度泵、G1379A在線脫氣裝置、G1329B自動進樣器），Agilent 1100化學工作站；色譜柱為Apollo C18柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）。檢測波長254 nm；流速為1 mL·min-1；檢測溫度為25 ℃；進樣量20 μL，流動相A乙腈，B 1%醋酸溶液，流動相梯度為0 min，90% B；15 min， 80% B；35 min， 70% B；45 min，50% B；50 min，40% B；55～65 min，30% B；70 min，50% B；75 min，70% B；80 min，90% B。
1.7數據分析本實驗中的所有數據都是采用至少3個重複，以±s表示。采用單因素方差法（One-Way ANOVA）分析不同誘導培養條件對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響。采用中藥指紋圖譜相似度評價係統（2004，A版）分析愈傷組織次生代謝產物的多樣性的差異。
2結果與討論
2.1不同誘導培養條件對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響為考察不同誘導培養條件對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響，分別選取了一些典型的誘導條件包括甘草種屬、外植體、光照條件和激素組合進行了5組試驗。其中，處理組A和B，C和D，A和C，D和E分別考察2種甘草種屬、光和暗條件、2種外植體、2種激素組合對甘草愈傷組織總黃酮含量的影響。
在本研究中，采用甘草苷為對照品，以甘草苷的濃度C為橫坐標，以吸光度A為縱坐標，測得甘草苷對照品的回歸曲線為Y= 0.015 8X，R2=0.999 1，實驗表明對照品質量濃度在20～100 μg·L-1與吸光度A呈良好的線性關係。檢測栽培甘草根和甘草愈傷組織中總黃酮的含量，結果表明，5種誘導培養條件下獲得的愈傷組織中總黃酮的質量分數為15～60 mg·g-1幹重，比相同種屬栽培甘草根中總黃酮的含量（GI為120 mg·g-1幹重，GG為55 mg·g-1幹重）要低很多。相同培養條件下，不同種屬的甘草誘導的愈傷組織中總黃酮的含量不同，脹果甘草誘導的愈傷組織（處理A）中總黃酮為25 mg·g-1幹重，高於光果甘草誘導的愈傷組織（處理B）中總黃酮的15 mg·g-1幹重；24 h連續光照條件下誘導培養的愈傷組織（處理D）總黃酮的質量分數（60 mg·g-1幹重）要遠高於24 h黑暗條件下（處理C）培養的愈傷組織總黃酮（20 mg·g-1幹重），這與楊世海等[9]利用烏拉爾甘草下胚軸為外植體在白色光照（熒光燈連續照射）和黑暗（24 h）培養愈傷組織進行有效成分分析時，得出的愈傷組織在光照條件下合成的黃酮類化合物的總量是黑暗條件下合成的化合物總量的2倍的結論一致。處理D，E的甘草愈傷組織中總黃酮含量都很高，但相差不大。在選取考察的5個誘導培養條件中，脹果甘草的子葉為外植體在光照下誘導時選取的這2個激素都比較適合進行甘草愈傷組織總黃酮的生產。實驗結果采用單因素方差分析法（One-Way ANOVA）進行分析，甘草種屬、外植體和光照條件對甘草愈傷組織中總黃酮的含量具有極其顯著的影響，然而，激素組合對甘草愈傷組織中總黃酮的含量無顯著影響。植物細胞中黃酮類化合物的合成受誘導培養條件的影響，這與楊世海等[10]以烏拉爾甘草胚軸為外植體，以不同類型的培養基、不同培養基pH、培養基中添加不同激素等條件誘導並培養甘草愈傷組織，得到的愈傷組織中黃酮類化合物的含量不同的結論一致。