百尾參止咳活性成分研究
化學
作者：甘秀海 趙超 梁誌遠 龔小見 陳華國 周欣
[摘要] 采用小鼠氨水引咳法研究百尾參Disporum cantoniense的止咳作用，利用各種現代色譜技術手段對止咳活性部位進行化學成分分離與純化，並根據化合物的理化性質和光譜數據鑒定結構。結果表明百尾參水提取物及乙醇提取物均有止咳活性，而乙醇提取物高劑量組的止咳作用高於陽性對照；從乙醇提取物中首次分離並鑒定了8個化合物，分別為豆甾-4-烯-3-酮（1），麥角甾-5， 7， 22-三烯-3β-醇（2），obtucarbamate A（3），obtucarbamate B（4）， neotigogenin（5），偶氮-2， 2′-雙 [Z-（2， 3-二羥基-4-甲基-5-甲氧基）苯基乙烯]（6），dimethyl {[carbonylbis（azanediyl）]bis（2-methyl-5，1-phenylene）}dicarbamate（7），槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8），活性跟蹤顯示化合物3，4，6具有止咳作用，其中化合物6的止咳作用與陽性對照相當。
[關鍵詞]百尾參；止咳活性；偶氮化合物；化學成分
百尾參為百合科Liliaceae萬壽竹屬植物萬壽竹Disporum cantoniense（Lour.）Merr.。其味甘、淡，性平，具有潤肺止咳、健脾消積的功效，可用於治療虛損咳喘、痰中帶血、腸風下血、食積脹滿等症[1-2]。百尾參是苗族習用藥材，是複方製劑咳速停係列藥物的主藥。目前，關於百尾參的研究主要集中在栽培方麵[3-6]，對其化學成分及生物活性研究較少[7-10]。為了探究百尾參的止咳活性成分，采用小鼠氨水引咳法首先研究了百尾參的止咳活性部位，其乙醇提取物具有明顯的止咳作用；其次對乙醇提取部位的化學成分進行了係統的分離，從中分離鑒定了8個化合物，分別為豆甾-4-烯-3-酮（1），麥角甾-5， 7， 22-三烯-3β-醇（2），obtucarbamate A（3），obtucarbamate B（4），neotigogenin（5），偶氮-2， 2′-雙 [Z-（2， 3-二羥基- 4-甲基-5-甲氧基）苯基乙烯]（6），dimethyl {[carbonylbis（azanediyl）]bis（2-methyl-5，1-phenylene）}dicarbamate（7），槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8），以上化合物均為首次從該植物中分離得到；最後對分離得到的量大的化合物3，4及6進行了活性測試，結果顯示3個化合物均有止咳作用，其中化合物6的止咳活性與陽性對照相當。
1材料
昆明種小鼠（SPF級），雌雄對半，體重18～22 g，由長沙東創實驗動物科技服務部提供，合格證號SCXK（湘）2009-0012。
磷酸可待因口服液Ⅲ，香港萬輝藥業有限公司，批號。乙醇為食用級，其餘試劑均為分析純試劑，重慶川東化工（集團）有限公司化學試劑廠。
X-4 型熔點儀，溫度未校正，北京泰克儀器有限公司生產；ZF7三用紫外分析儀，購於鞏義市予華儀器有限責任公司；INOVO 400 MHz型核磁共振波譜儀（TMS為內標），美國Varian公司生產，JEOL ECX-500 MHz型核磁共振波譜儀（TMS為內標），日本電子株式會社生產；HP 5973質譜儀，美國安捷倫公司生產；柱色譜矽膠（200～300目）和薄層用矽膠GF254，青島海洋化工廠生產；Sephadex LH-20，購自Pharmacia公司。
藥材於2010年8月采自貴州省安順市，原植物經貴州師範學院朱富壽教授鑒定為百尾參D.cantoniense，標本保存於貴州師範學院藥用植物研究所。
2方法
2.1提取物的製備
取上述2份百尾參藥材粗粉各40 g，精密稱定，分別加入8倍量食用乙醇、蒸餾水加熱回流提取2次，每次3 h，合並2次濾液，減壓濃縮至浸膏，精密稱定，計算各溶劑提取物得膏率：乙醇5.7%，水25.8%。
2.2止咳活性研究[11]
取小鼠90隻，雌雄各半，隨機分成9組，即乙醇提取物高、低劑量組，水提取物高、低劑量組（生藥量5.80，1.25 g·kg-1），生理鹽水對照組（空白對照組），磷酸可待因口服液陽性對照組（300.0 mg·kg-1），單體化合物3，4，6組（300.0 mg·kg-1），每組10隻。每天灌胃（ig）給藥1次，給藥體積按20 mL·kg-1，連續給藥6 d。末次給藥1 h後，利用氨水氣霧引咳法，用超生霧化器均勻地霧化濃氨水於倒扣的500 mL密閉玻璃鍾罩內，然後迅速將小鼠放入鍾罩內，噴霧5 s，觀察記錄小鼠的咳嗽潛伏期（從放入開始至咳嗽的時間）和2 min內咳嗽的次數。
結果以±s表示，實驗數據采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學處理，采用單因素方差分析，顯著性檢驗標準為P
2.3化學成分的提取分離
百尾參幹燥根15 kg粉碎後，用85%工業乙醇加熱回流提取3次，濾過，合並提取液，減壓濃縮得浸膏1.6 kg，加入2倍量水分配，依次用醋酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收溶劑，得到醋酸乙酯萃取物217 g、正丁醇萃取物386 g。醋酸乙酯萃取物經矽膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇（1∶0， 20∶1， 5∶1， 1∶1）梯度洗脫，得到Ⅰ～Ⅵ6個部分。第Ⅱ部分（56 g）經矽膠柱色譜分離，用石油醚-醋酸乙酯（8∶1， 3∶1， 1∶1）洗脫，得3個亞組分（Ⅱ1～Ⅱ3），Ⅱ1組分經矽膠柱色譜分離，用石油醚-丙酮（10∶1）洗脫，再經重結晶純化，得到化合物1（12 mg），2（16 mg）；組分Ⅱ3經矽膠柱色譜分離，以石油醚-醋酸乙酯（5∶1）洗脫，經石油醚-醋酸乙酯重結晶得到化合物3（15.8 g），4（9.6 g）。第Ⅲ部分（28 g）經柱色譜分離，用石油醚-丙酮（5∶1）洗脫、再經重結晶純化，得到化合物5（16 mg），6（1.4 g）。第Ⅳ部分（29 g）經反複柱色譜分離，用三氯甲烷-甲醇（10∶1）和石油醚-丙酮（3∶1）洗脫，再Sephadex LH-20和重結晶純化得到化合物7（21mg）。正丁醇萃取物經矽膠柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇（10∶1， 5∶1， 1∶1）梯度洗脫，得到A～D 4個部分，B部分（65 g）經反複柱色譜分離，以三氯甲烷-甲醇（5∶1）洗脫，再經Sephadex LH-20及重結晶純化，得到化合物8（18 mg）。
3結果與分析
3.1百尾參提取物及單體化合物對氨水氣霧致小鼠咳嗽的影響
實驗結果表明，陽性藥物、水及食用乙醇提取物高、低劑量組均有延長小鼠咳嗽潛伏期和減少小鼠咳嗽次數的作用（P
3.2結構鑒定
化合物1 白色粉末；mp 99～101 ℃；EI-MS m/z（%）412（M+·），397，368，229，124（100），57，43；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ： 5.72（1H，s，H-4），1.18（3H，s，19-CH3），0.92（3H，d，J=6.4 Hz，21-CH3），0.85（3H，d，J=7.2 Hz， 29-CH3），0.84（3H，d，J=7.2 Hz，26-CH3），0.81（3H，d，J=6.4 Hz，27-CH3），0.71（3H，s，18-CH3）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ： 35.8（C-1），33.6（C-2），199.5（C-3），124.1（C-4），171.0（C-5），32.7（C-6），32.3（C-7），35.4（C-8），54.0（C-9），38.7（C-10），21.1（C-11），40.1（C-12），42.6（C-13），56.0（C-14），23.8（C-15），28.4（C-16），56.1（C-17），12.4（C-18），17.5（C-19），36.8（C-20），18.9（C-21），34.5（C-22），26.2（C-23），45.8（C-24），29.0（C-25），20.2（C-26），18.6（C-27），22.9（C-28），12.1（C-29）。以上數據與文獻[12]報道的豆甾-4-烯-3-酮基本一致。
化合物2 白色晶體（石油醚-丙酮）；mp 151～152 ℃；EI-MS m/z （%）396（M+·）（100），382，329，255，69，55；1H-NMR（CDCl3，400 MHz）δ： 5.62（1H，m，H-6），5.35（H，m，H-7），5.12～5.24（2H，m，22，H-23），3.58（1H，m，H-3），1.05（3H，d，J=6.8 Hz，21-CH3），0.93（3H，s，19-CH3），0.89（3H，d，J=7.0 Hz，28-CH3），0.84（3H，d，J=7.0 Hz，27-CH3），0.82（3H，d，J=6.8 Hz，26-CH3），0.65（3H，s，18-CH3）；13C-NMR（CDCl3，100 MHz）δ： 38.8（C-1），32.2（C-2），70.5（C-3），40.6（C-4），140.0（C-5），120.2（C-6），116.3（C-7），141.4（C-8），46.2（C-9），37.7（C-10），21.1（C-11），39.8（C-12），42.7（C-13），55.0（C-14），23.2（C-15），28.0（C-16），56.0（C-17），12.1（C-18），16.5（C-19），40.8（C-20），21.4（C-21），135.5（C-22），132.2（C-23），42.8（C-24），33.0（C-25），20.0（C-26），19.6（C-27），17.8（C-28）。以上光譜數據與文獻[13]報道的麥角甾-5，7，22-三烯-3β-醇基本一致。