荷梗中的細胞毒活性生物堿
化學
作者：段緒紅 裴林 蔣建勤
[摘要] 研究植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn幹燥莖的生物堿類成分及其細胞毒活性，為進一步開發利用荷梗提供依據。采用離子交換樹脂、矽膠和Sephadex LH-20柱色譜等方法分離純化，並運用波譜方法對所分離的化合物進行結構鑒定。采用MTT法對所分離得到的化合物進行HL-60癌細胞毒活性實驗。從荷梗總生物堿提取物中分離鑒定了15個生物堿類化合物，分別為阿西米洛賓（1）、異烏藥堿（2）、N-乙酰基去甲杏黃罌粟堿（3）、厚殼桂素（4）、velucryptine（5）、pycnarrhine（6）、鵝掌楸堿（7）、荷葉堿（8）、降荷葉堿（9）、杏黃罌粟堿（10）、N-甲基阿西米洛賓（11）、烏藥堿（12）、N-去甲杏黃罌粟堿（13）、N-甲基烏藥堿（14）、觀音蓮明（15）。化合物1～7，12～15為首次從荷梗中分離得到。化合物2～6為首次從蓮科植物中分離得到。在樣品溶液濃度為1×10-5 mol·L-1的條件下，化合物7～10，13，14對HL-60癌細胞體外生長的抑製率分別是51.36%，59.09%，52.51%，53.93%，51.43%和64.31%，表明上述化合物對人早幼粒細胞白血病HL-60細胞具有較明顯的體外細胞毒活性。
[關鍵詞]蓮；荷梗；生物堿；細胞毒活性
蓮屬於睡蓮科Nymphaeaceae 蓮亞科Subfam. Nelumboideae，為多年生水生草本植物，在我國南北各省都有分布。其幹燥葉具有清暑化濕、升發清陽、涼血止血之功效，主要用於暑熱煩渴、暑濕泄瀉、脾虛泄瀉、血熱吐衄、便血崩漏等[1]。國內外學者已對荷葉的化學成分進行了係統的研究，發現其主要含有生物堿類、黃酮類、有機酸類成分[2-3]。而荷梗的化學成分研究報道較少，作者對其生物堿類成分進行了較深入的研究，發現了一個新的假苄基異喹啉型生物堿[4]。在此基礎上，進一步對其生物堿類成分進行了研究，從其總生物堿提取物中分離得到15個化合物。經波譜方法分別鑒定為阿西米洛賓（1）、異烏藥堿（2）、N-乙酰基去甲杏黃罌粟堿（3）、厚殼桂素（4）、velucryptine（5）、pycnarrhine（6）、鵝掌楸堿（7）、荷葉堿（8）、降荷葉堿（9）、杏黃罌粟堿（10）、N-甲基阿西米洛賓（11）、烏藥堿（12）、N-去甲杏黃罌粟堿（13）、N-甲基烏藥堿（14）、觀音蓮明（15）。其中，化合物1～7，12～15為首次從荷梗中分離得到。化合物2～6為首次從蓮科植物中分離得到。采用MTT法對所分離得到的15個化合物進行細胞毒活性的初篩，結果表明：化合物7～10，13，14對HL-60癌細胞具有較明顯的體外細胞毒活性。在1×10-5 mol·L-1的條件下，對HL-60癌細胞體外生長的抑製率分別是51.36%，59.09%，52.51%，53.93%，51.43%和64.31%。
1材料
熔點用X-4數字顯示顯微熔點儀（溫度未校正）；電噴霧電離質譜（ESI-MS）使用HP-1100LC/API/MSD係統；Bruker AV-300和AV-500核磁共振儀（TMS內標）；循環水真空泵 DLSB-10L（鞏義市英峪儀器廠）；KQ-300 超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；柱色譜用矽膠（100～200，200～300 目，青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（Pharmacia公司）；IRC-50型離子交換樹脂（國藥集團化學試劑有限公司）；所用試劑均為分析純。
實驗藥材於2005年10月采自福建省建寧市，經建寧市科技局薑景魁工程師鑒定為蓮科植物N.nucifera的幹燥莖。憑證樣品（N）保留在中國藥科大學天然藥物化學教研室。
2提取與分離
荷梗幹燥樣品30 kg經適當粉碎後，用0.5%稀鹽酸溶液浸提3次，每次48 h，浸出液合並，濾過，通過IRC-50型陽離子交換樹脂，樹脂水洗，陰幹後用濃氨水堿化，風幹，以氯仿索氏回流至生物堿提盡，提取液合並，減壓濃縮，得浸膏55 g。浸膏用少量混合溶劑溶解，加入60 g（200～300 目）矽膠均勻拌樣，揮幹溶劑後，用600 g矽膠（200～300 目）進行柱色譜分離，以氯仿-甲醇作為洗脫劑進行梯度洗脫（1∶0～0∶1），合並TLC行為大致相同的組分，得到8 個不同極性段組分：A（100∶0），B（50∶1），C（20∶1），D（10∶1），E（5∶1），F（3∶1），G（1∶1），H（0∶1）。對組分A（2.6 g）進一步矽膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮（3∶1～1∶1）進行梯度洗脫，得到5個流分FrA1～FrA5，FrA1矽膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯（30∶1）洗脫，得化合物1（18 mg），FrA2矽膠柱色譜以二氯甲烷-丙酮（50∶1）洗脫，得化合物11（205 mg），FrA4經Sephadex LH-20 柱色譜（甲醇洗脫）分離純化，得到化合物3（11 mg），9（35 mg）。對組分B（3.1 g）進一步矽膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（3∶1）作為洗脫溶劑反複進行柱色譜分離，得到化合物7（130 mg），13（28 mg），14（13 mg）。對組分C（1.5 g）進一步矽膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮（5∶1）和氯仿-甲醇（15∶1）作為洗脫溶劑反複進行柱色譜分離，再經Sephadex LH-20 柱色譜（甲醇洗脫）分離純化，得到化合物2（20 mg），12（9 mg）。對組分D（8.7 g）進一步矽膠柱色譜分離，以氯仿-丙酮（4∶1～1∶1）梯度洗脫得到4個流分FrD1～FrD4，FrD1首先經SephadexLH-20柱色譜初步分離，以氯仿-甲醇（1∶1）為洗脫溶劑，然後以石油醚-丙酮（2∶1）作為洗脫溶劑反複進行矽膠柱色譜分離，得到化合物8（1 500 mg），FrD2以氯仿-甲醇（8∶1）作為洗脫溶劑反複進行矽膠柱色譜分離，得到化合物10（6.6 mg），15（9.2 mg）。對組分E（2.3 g）進一步矽膠柱色譜分離，以氯仿-甲醇（5∶1～1∶1）梯度洗脫得到3個流分FrE1～FrE3，FrE1首先以氯仿-丙酮（3∶1）為洗脫溶劑反複進行矽膠柱色譜分離，再經SephadexLH-20柱色譜（甲醇洗脫）分離純化，得到化合物4（16 mg），FrE3以二氯甲烷-甲醇（2∶1）為洗脫溶劑反複進行矽膠柱色譜分離，得到化合物5（10 mg）。組分F（0.8 g）經Sephadex LH-20 柱色譜（甲醇洗脫）分離純化，反複重結晶後，得到化合物6（8 mg）。
3結構鑒定
化合物1 無色塊晶（CHCl3）；改良碘化鉍鉀試劑顯橘紅色；1H-NMR（CD3COCD3，300 MHz）δ：8.32（1H，d，J=7.9 Hz，H-11），7.18～7.31（3H，m，H-8～10），6.63（1H，s，H-3），3.67（1H，dd，J=4.6，9.1 Hz，H-6a），3.57（3H，s，-OMe），2.54～3.31（6H，m，H-4，5，7）；13C-NMR（CD3COCD3，75 MHz）δ： 144.5（C-1），126.5（C-1a），129.6（C-1b），150.0（C-2），116.4（C-3），131.1（C-3a），30.4（C-4），44.1（C-5），54.8（C-6a），38.4（C-7），137.8（C-7a），128.8（C-8），128.4（C-9），128.1（C-10），127.7（C-11），133.5（C-11a），60.4（1-OMe）。以上數據與文獻[5]報道基本一致，鑒定為阿西米洛賓。
化合物2 白色顆粒狀結晶（MeOH）；改良碘化鉍鉀試劑顯橘紅色；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：7.05（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′），6.68（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′），6.44（1H，s，H-5），6.65（1H，s，H-8），3.88（1H，dd，H-1），3.67（3H，s，-OMe），2.49～3.05（6H，m，H-3，4，9），1.80（1H，s，N-H）；13C-NMR（DMSO-d6，75 MHz）δ： 56.5（C-1），41.4（C-3），28.8（C-4），127.3（C-4a），115.4（C-5），145.5（C-6），144.5（C-7），110.6（C-8），129.7（C-8a），39.9（C-9），129.8（C-1′），130.2（C-2′），114.9（C-3′），155.5（C-4′），114.9（C-5′），130.2（C-6′），55.6（7-OMe）。以上數據與文獻[6]報道基本一致，鑒定為異烏藥堿。
化合物3 無色針狀結晶（CHCl3）；改良碘化鉍鉀試劑顯橘紅色；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：7.06（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′），6.70（1H，s，H-8），6.68（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′），6.61（1H，s，H-5 ），3.94（1H，dd，H-1），3.70（3H，s，-OMe），3.65（3H，s，-OMe），2.58～3.07（6H，m，H-3，4，9），1.89（3H，s，-Me）；13C-NMR（DMSO-d6，75 MHz）δ： 56.1（C-1），40.4（C-3），27.3（C-4），125.5（C-4a），111.7（C-5），147.7（C-6），148.2（C-7），109.4（C-8），126.8（C-8a），39.4（C-9），126.9（C-1′），130.3（C-2′），116.1（C-3′），156.1（C-4′），116.1（C-5′），130.3（C-6′），56.0（6-OMe），55.9（7-OMe），22.6（-Me），177.3（CO）。以上數據與文獻[7]報道基本一致，鑒定為N-乙酰基去甲杏黃罌粟堿。
化合物4 無色針刺狀結晶（CHCl3）；改良碘化鉍鉀試劑顯橘紅色；1H-NMR（CDCl3，300 MHz）δ： 8.34（1H，d，J=5.7 Hz，H-3），7.43（1H，d，J=5.7 Hz，H-4），7.32（1H，s，H-8），7.08（2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′），7.05（1H，s，H-5），6.67（2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′），4.00（3H，s，-OMe），3.89（3H，s，-OMe）；13C-NMR（CDCl3，75 MHz）δ： 158.3（C-1），140.7（C-3），118.4（C-4），133.0（C-4a），105.7（C-5），152.3（C-6），149.7（C-7），104.5（C-8），122.2（C-8a），40.6（C-9），130.1（C-1′），129.7（C-2′），115.3（C-3′），155.7（C-4′），115.2（C-5′），129.6（C-6′），55.8（6-OMe），55.7（7-OMe）。以上數據與文獻[8]報道基本一致，鑒定為厚殼桂素。