2.5腫瘤體積、瘤重及腫瘤生長曲線檢測造模第5天用遊標卡尺第1次測量瘤體長徑L（mm）和短徑W（mm），之後每隔2 d測1次，根據公式V=（L+W）LW（0.261 8）[14]，計算瘤體積V（mm3），繪製各組腫瘤生長曲線。末次給藥後24 h，稱動物體重後頸椎脫臼處死，觀察腹部兩側血管的粗細，拍照。剖取移植瘤體組織稱重。計算抑瘤率=（1-治療組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。
2.6活體熒光成像和肺部轉移灶的計數給藥第30天，每組選取5隻小鼠，每隻注射熒光素酶底物0.1 mL，吸入式麻醉後進行活體熒光成像檢測。末次給藥後24 h，剖取肺，10%福爾馬林溶液灌注後固定，48 h後計數肺表麵的轉移瘤結節數。
2.7蘇木素-伊紅染色（HE）每組選取3個肉瘤組織用多聚甲醛固定，最大切麵取材，切片機切片（厚度為 8 μm），進行HE染色。普通光學顯微鏡觀察各組病理表現和特點，數碼相機采集圖像。
2.8免疫組化染色石蠟切片經二甲苯、梯度乙醇處理後，PBS（pH 7.4）衝洗 3 次，每次3 min。切片置於改進型檸檬酸鈉抗原修複液（pH 8.0）中，微波處理 15 min，室溫冷卻，PBS 衝洗 3 次，每次 5 min。隨後加入 50 L的3% H2O2去離子水室溫孵育 10 min，以消除內源性過氧化物酶活性。封閉後加入相應一抗，37 ℃孵育 4 h，PBS 衝洗 3 次，加入生物素標記的二抗，孵育 15 min，PBS 衝洗後加Streptavidin Herseradish Peroxidase Conjugated工作液，孵育15 min，PBS 衝洗後，加入新鮮配置的 DAB 顯色溶液，顯色 5～10 min。自來水衝洗，蘇木素複染 15 min。分化液分化 5 s，自來水衝洗，脫水後樹膠封片，光學顯微鏡觀察。
2.9統計學處理采用統計分析軟件SPSS 17.0進行統計學處理。連續型變量用±s表示，分別采用單因素方差分析（One-way ANOVA）、兩兩比較的Student′s t-test分析實驗結果，P-1均可顯著性抑製4T1細胞增殖（P-1，呈明顯的濃度依賴性。結晶紫法染色發現，TP在0.01～100 μmol·L-1，對4T1細胞有抑製增殖作用（P-1時，存活率僅為對照組的11%。
3.2TP對腫瘤生長和轉移的抑製作用與模型組比較，TP各劑量組與Dox組從給藥第4 天開始，腫瘤體積大小有顯著性差異（P-13個濃度都顯著誘導4T1細胞的凋亡，凋亡率分別為63.8%，49.6%，23.3%（對照組凋亡率為19.9%）。
TP顯著增強凋亡晚期細胞和壞死細胞的比例，凋亡晚期細胞比例由對照組的7.7%分別上升為12.0%（TP為0.1 μmol·L-1），21.5%（TP 1 μmol·L-1）和26.7%（TP 10 μmol·L-1）；壞死率由對照組的0.9%分別上升為5.2%（TP 0.1 μmol·L-1），17.9%（TP 1 μmol·L-1）和30.7%（TP 10 μmol·L-1）。
3.5TP抑製4T1荷瘤小鼠在體腫瘤增殖和肺部轉移病理切片顯示，模型組腫瘤細胞較大，細胞核大，排列密集。TP（200 μg·kg-1）組腫瘤組織中細胞明顯較疏散，細胞核較小，壞死區域增加。肺組織切片可見，模型組小鼠肺轉移瘤病灶區域較大，轉移灶處細胞密集，且明顯大於正常肺組織細胞。TP各給藥組肺組織中均可見肺轉移瘤病灶，其中TP（200 μg·kg-1）轉移瘤病灶麵積最小，TP（100 μg·kg-1）次之。
3.6TP抑製腫瘤組織中ERα，ERβ的表達，抑製ERα，ERβ磷酸化與模型組比較，TP中劑量組的ERα，ERβ表達明顯減弱，特別是ERα的表達。西點法的結果顯示，與對照組相比，TP各給藥組ERα，ERβ，p-ERα，p-ERβ的蛋白表達都隨著濃度的增加而下調，TP 1 μmol·L-1處理細胞2 h 後，ERα，ERβ，p-ERα，p-ERβ的蛋白表達水平分別降低至對照組的75.6%，56.2%，64.0%，92.7%。TP對4T1細胞ERK，p-ERK，p38，p-p38，SAPK/JNK及p-SAPK/JNK的表達水平無影響。
4討論
BALB/c小鼠移植4T1乳腺癌轉移模型類似於高侵入性人類IV期轉移性乳腺癌，采用熒光報告基團標記細胞構建此模型，結合活體動物體內熒光成像技術，可實時活體觀測動物體內腫瘤細胞的生長和轉移。本研究采用以上技術，研究雷公藤甲素對4T1乳腺癌荷瘤小鼠腫瘤生長及轉移的作用，並進一步從雌激素受體水平與MAPK信號傳導通路探索其可能的作用機製。
研究證實TP對小鼠乳腺癌細胞4T1有明顯的抑製增殖作用，能誘導細胞凋亡。動物實驗結果表明，雷公藤甲素也能抑製4T1小鼠乳腺癌細胞在體的增殖。此外，與模型組比較TP各給藥組小鼠肺轉移瘤病灶區麵積減小，其中中劑量組麵積最小。提示TP劑量為200 μg·kg-1時可能具有潛在的抑製腫瘤轉移的作用。
有報道指出，TP對ERα蛋白介導的人乳腺癌細胞MCF-7增殖抑製作用的機製可能與下調ERα表達、誘導細胞凋亡相關[15]。本研究也顯示，TP抑製腫瘤組織中ERα，ERβ的表達，抑製ERα，ERβ磷酸化，但不影響MAPK通路蛋白的磷酸化，提示雷公藤甲素主要起到抑製腫瘤增殖的作用，其機製與抑製ERα，ERβ的表達和磷酸化有關，但TP的抑製腫瘤增殖作用與MAPK通路的活化無關。
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