雷公藤甲素通過抗ER磷酸化抑製小鼠4T1乳腺癌增殖作用研究
藥理
作者：潘國鳳 高建莉 張奇 呂圭源 陳素紅
[摘要] 雷公藤甲素（triptolide，TP）具有顯著的抑製腫瘤作用。本研究采用MTT法和結晶紫染色法檢測TP對小鼠乳腺癌細胞4T1增殖的影響；流式細胞儀檢測TP誘導的4T1細胞凋亡率；Western blot檢測4T1中相關蛋白雌激素受體α（estrogen reporter α，ERα），磷酸化ERα（p-ERα），ERβ，p-ERβ，細胞外信號調節的蛋白激酶（ERK），p-ERK，p38，p-p38，c-Jun氨基末端激酶（SAPK/JNK），p-SAPK/JNK的表達。給藥30 d後，活體熒光示蹤技術觀察TP對4T1-Luc細胞接種的BALB/c 雌性小鼠乳腺癌的熒光強度，同時檢測腫瘤體積和質量，計算抑瘤率。腫瘤組織蘇木素-伊紅（HE）染色後觀察病理變化；免疫組織化學法（IHC）分析腫瘤組織ERα及ERβ的表達情況。發現TP體外濃度為100，10，1，0.1 μmol·L-1時可顯著抑製4T1乳腺癌細胞的增殖，誘導細胞凋亡。TP劑量為200 μg·kg-1時能抑製小鼠乳腺癌的增殖，TP的抗乳腺癌增殖作用與降低ERα，ERβ的磷酸化密切相關，但與MAPK通路的活化無明顯相關性。
[關鍵詞]雷公藤甲素；小鼠4T1乳腺癌細胞；抑製增殖；雌激素受體；活體熒光示蹤
傳統中藥雷公藤具有多種藥理作用[1]，研究表明雷公藤有很好的抗腫瘤活性[2]，主要抗腫瘤有效成分是雷公藤甲素（triptolide，TP）。眾多研究表明TP是一種廣譜腫瘤抑製劑，對乳腺癌[3]、T細胞淋巴瘤[4-5]、肝細胞癌[6-7]、肺癌[8]、胰腺癌[9]、前列腺癌[10]等多種腫瘤具有抑製作用，其中以直腸癌細胞株HCT 116和乳腺癌細胞株MCF-7最為敏感。許多研究資料表明，內源性或外源性雌激素水平與乳腺癌的發生、發展密切相關[10-12]。細胞膜及胞漿上的雌激素受體（estrogen receptor，ER）與雌激素結合後產生效應，靶器官不同，所產生的作用也不同，取決於體內各個不同組織中ER的含量[13]。本課題擬研究雷公藤甲素對小鼠乳腺癌細胞4T1增殖的影響，並進一步研究雌激素受體的活化水平與雷公藤甲素抗乳腺癌細胞增殖的可能作用機製。
1材料
1.1細胞株與動物小鼠乳腺癌細胞株4T1及熒光素酶標記的4T1-Luc細胞由美國芝加哥大學何通川教授惠贈。細胞用DMEM 完全培養基（含10%胎牛血清、青黴素1×105 U·L-1、鏈黴素100 mg·L-1），在37 ℃、飽和濕度及5%CO2的細胞培養箱內培養，每1～2 d傳代1 次。整個實驗過程中用台盼藍染色實驗檢測細胞活性。雌性BALB/c小鼠，體重18～22 g，60隻。許可證號SCXK（滬）2008-0016，SPF級，購於上海西普爾必凱實驗動物有限公司。
1.2試劑 TP（上海同田生物技術股份有限公司，純度≥98%，批號）；陽性對照藥阿黴素（浙江省腫瘤醫院，批號0QL0073）；DMEM高糖培養液，0.25% Trypsin，0.02% EDTA，0.25% 胰酶溶液（吉諾生物醫藥技術有限公司）；噻唑藍（MTT），二甲基亞碸（DMSO）（Sigma公司）；0.4% 台盼藍溶液，高效RIPA組織/細胞裂解液（Solarhio）；FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I（BD Pharmingen）；ERα（C-311），p-ERα（Ser118），ERβ（H-150），p-ERβ（Ser87）（Santa Cruz公司）；MAPK Family Antibody Sampler Kit，Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit（Cell Signaling）；Streptavidin Herseradish Peroxidase Conjugated（Thermo scientific）；Chemiluminescent detection reagent（advansta）；牛血清白蛋白（BSA）、磷酸鹽緩衝液（PBS）、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Actin抗體（β-actin）、生物素標記山羊抗兔IgG（H+L）二抗、生物素標記山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗、改進型抗原修複液（碧雲天生物技術研究所）；DAB-Puffertabletten（默克公司）。蘇木精-伊紅（HE）染液（南京建成生物工程研究所）。
1.3儀器熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS）；轉移電泳槽（上海天能科技有限公司）；酶聯免疫檢測儀（美國Bio-TeR，美國）；化學發光成像儀（北京賽智創業科技有限公司）；XENOGEN IVIS System（冷泉港，美國）。
2方法
2.1細胞增殖能力檢測 MTT法：取對數生長期細胞，1.0×104個/孔接種於96孔培養板，37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h。設溶劑對照孔、空白孔、不同濃度TP組，每組3個複孔。給藥後培養48 h，每孔加入5 g·L-1 MTT 20 μL，繼續培養4 h後，終止，每孔加入150 μL DMSO，搖床低速振蕩10 min。酶聯免疫檢測儀570 nm波長下測定吸光度，實驗重複3次。存活率=藥物組平均吸光度/對照組平均吸光度×100%，計算細胞的存活率。
結晶紫染色法：取對數生長期細胞，5.0×104個/孔接種於24孔培養板，培養24 h。設溶劑對照孔、空白孔、不同濃度TP組，每個劑量設3個複孔。給藥後培養48 h，棄去培養液，每孔加入300 μL 0.2%結晶紫染液，室溫染色30 min後洗去染料，用20%的醋酸溶液溶解結晶，搖床振搖10 min後，酶聯免疫檢測儀540 nm波長下測各孔吸光度。按上述公式計算細胞存活率。
2.2FITC-Annexin V/PI法檢測細胞凋亡率取對數生長期細胞，製備濃度為1×106個/mL細胞懸液接種於60 mm培養皿中，置37 ℃，5% CO2培養箱培養24 h後，棄掉培養液，加入不同濃度的TP，使其終濃度為10，1，0.1 μmol·L-1，同時設對照組，繼續培養24 h後，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞置離心管，1 000 r·min-1離心5 min，冷PBS清洗。1×Binding Buffer重懸細胞至1×106個/mL，加入FITC-Annexin V避光孵育15 min，加10 μL PI（250 mg·L-1）溶液染色15 min後上機檢測。
2.3Western blotting法檢測相關蛋白表達取對數生長期細胞，不同濃度TP處理2 h後，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，冷PBS清洗後加裂解液300 μL（含1%蛋白酶磷酸酶抑製劑混合液），4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min，吸取上清240 μL；BCA法測定蛋白濃度，將不同樣品調至相同濃度，5×Loading buffer混合95 ℃煮沸5 min充分變性蛋白。10% SDS-PAGE凝膠分離樣品，400 mA 恒流240 min轉至PVDF膜，以相應的一抗和二抗孵育，將膜置於凝膠成像係統中，ECL化學發光後成像。
2.4動物模型建立、分組及給藥 BALB/c 雌性小鼠腹部脫毛，用異氟烷吸入式麻醉，仰臥固定，在小鼠右側倒數第二對乳腺脂肪墊下接種5×105個4T1-Luc細胞，建立小鼠乳腺癌轉移模型。接種48 h後，觀察腫瘤生長狀況，隨機分為5組，每組10隻，模型組（0.9%生理鹽水）、Dox陽性藥組（1 mg·kg-1）、TP低、中、高劑量組（100，200，400 μg·kg-1），另設未造模正常對照組。TP組分別灌胃給予10，20，40 mg·L-1的TP溶液，對照組、模型組按體重進行灌胃給予含1% DMSO的生理鹽水，灌胃容積均為0.01 mL·g-1體重，造模48 h後開始給藥，每天灌1次，連續30 d。陽性藥Dox按成人40 mg·m-2·d-1換算後以1 mg·kg-1劑量腹腔注射給藥，隔日給藥1次。實驗期間自由采食飲水。