基於體內外相結合的中藥大品種二次開發物質基礎研究思路
學術探討
作者：成旭東 賈曉斌 封亮 蔣俊
[摘要] 中藥大品種二次開發是中藥現代化、科學化、標準化進程的重要環節之一。如何準確有效地識別原方有效物質基礎是二次開發中最首要的難題，同時也是中藥現代化發展的瓶頸。該文在目前已有的試驗方法的基礎上，根據中藥複方多成分、複雜作用需要綜合多學科的方法與技術協同研究的思路，提出基於體內外相結合的中藥大品種二次開發物質基礎研究思路，認為物質基礎研究需要分為識別、篩選、驗證3個環節，每個環節設計相應的體內、外的研究方法相互補充、相互驗證，最終篩選正確可靠的複方物質基礎。該思路為中藥大品種二次開發以及複方物質基礎研究提供參考。
[關鍵詞]中藥大品種；二次開發；物質基礎；體內、外結合；研究思路
中藥大品種具有很好的臨床療效和患者認可度，在現代中醫藥臨床中發揮了重要作用。對中藥大品種進行二次開發是中藥現代化、科學化、標準化進程的重要環節之一。如何準確有效地識別原方中有效物質基礎並進行有效的質量控製是中藥工作者所麵臨的最主要的難題，同時也是決定中藥大品種二次開發成敗的決定性因素。本文以中藥體內外成分、效應有機結合為指導思想，提出基於體內外相結合的中藥大品種二次開發物質基礎研究思路，為中藥大品種二次開發以及複方物質基礎研究和複方開發提供部分參考。
1中藥複方物質基礎研究現狀
中藥複方具有君臣佐使的組方原則，其組方構成是一個具有一定層次與結構的有機整體。同時中藥複方中每味藥材又是由多類化學成分組成。因此，整體性和複雜性是中藥複方最大的特點，同時也是物質基礎研究麵臨的巨大難題。
目前中藥複方物質基礎研究方法分為傳統化學成分分離法、拆方研究法、血清藥理學/藥物化學法、譜效關係結合法、代謝組學研究法。
1.1傳統化學成分分離法
傳統化學成分分離法是研究中藥複方物質基礎最早、最經典的方法。中藥經過植物化學成分分離、純化、結構鑒定，得到的單一化合物，輔以藥理活性篩選加以確定；或者利用已有藥理模型對植物化學分離中的每個部位進行活性追蹤，對最終得到的化合物進行結構鑒定。袁勝浩等[1]利用矽膠、MCI和Rp-8等柱色譜方法對秋海棠科植物大半邊蓮的甲醇提取部位進行分離純化，並根據理化性質和光譜數據（MS，UV，IR，1H-NMR，13C-NMR）鑒定結構。采用比濁法測定單體化合物的最小抑菌濃度（MIC）。結果從大半邊蓮中分離得到6個酚酸類化合物，分別鑒定為水楊酸、間羥基苯甲酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸和原兒茶酸。其中，水楊酸和原兒茶酸的抑菌譜最廣，阿魏酸次之，間羥基苯甲酸最小；原兒茶酸的抑菌活性最強，間羥基苯甲酸最弱。
化學成分分離法成功研究了抗瘧新藥青蒿素，抗癌新藥紫杉醇、長春新堿，治療老年癡呆病的石杉堿甲等馳名海內外的產品。此方法可得到的結構明確、作用機製清晰的單一活性化合物。但是，此方法工作量大，成功率低，同時脫離了中醫藥範疇屬於純粹的天然藥物化學方法。
1.2拆方研究法
拆方研究可說明中藥複方的配伍組方原理及作用機製，為研製中藥大品種二次開發提供可靠的依據，是目前中藥複方研究中最為常用的一種方法[2]。李越峰等[3]研究四逆散拆方煎煮化學成分後發現，在配伍煎煮的過程中產生了新的成分，且成分溶出量研究表明各成分間存在明顯的相互增溶作用。潘岩等[4]研究左金丸及拆方對胃潰瘍大鼠胃黏膜愈合和表皮生長因子受體表達的影響，結果發現，左金丸及其拆方均有促進潰瘍愈合的作用，顯著性上調EGFR的表達可能是左金丸促進潰瘍愈合的重要機製之一。
1.3血清藥理學/藥物化學法
血清藥理學由日本學者20世紀80年代在對漢方的研究體係進行探討的過程中首次提出，是為了研究中藥複方而誕生的一種新的體外實驗方法。中藥血清藥理學是采集動物給予中藥或中藥複方一定時間的血液，分離血清，用含有藥物成分的血清進行體外細胞、亞細胞水平進行超微、生化、受體、基因等方麵研究的一種實驗方法。王威等[5]研究疏肝導濁方藥含藥血清對肝癌細胞株（HepG2）的過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARα），肝脂酶（HL）及載脂蛋白Apo B100，Apo AII，Apo CII mRNA表達的影響，結果表明，疏肝導濁方藥含藥血清能增加HepG2細胞PPARα，HL，ApoB100，Apo AII，Apo CII mRNA的表達，從而促進了肝細胞的脂代謝功能，這可能是疏肝導濁方藥治療脂肪肝的重要機製之一。張金豔等[6]利用含藥血清研究冠心蘇合丸係列組方藥物血清對心肌細胞缺氧複氧損傷的影響，結果表明，冠心蘇合丸係列組方對缺氧複氧心肌細胞損傷均有明顯保護作用，作用機製相似；原方中青木香被土木香替換或者去掉青木香，不影響其抗缺氧複氧損傷的作用。
中藥血清藥理學同時也存在一定的問題：如血清自身組分的複雜性至今尚未完全清楚，且血清本身固有成分會影響體外實驗的結果，還有實驗動物的種屬和年齡性別等因素對實驗結果的影響等[7]。
中藥血清藥物化學是以中藥口服給藥後的血清為樣品，以藥物化學的研究手段和方法為基礎，多種現代技術綜合運用，從血清中分離鑒定移行成分，研究血清中移行成分與傳統療效的相關性，闡明體內直接作用物質代謝及體內動態的領域[8]。吳芳芳等[9]利用UPLC-HDMS技術建立生脈散以及大鼠口服生脈散後含藥血清樣品的分析方法，通過對比空白血清、含藥血清的成分異同，確定大鼠口服生脈散後的血中移行成分，並利用質譜數據表征血中移行成分的結構，結果大鼠口服生脈散後在血中分析鑒定了18個血中移行成分，其中5個為新產生的代謝產物，13個成分為生脈散的原型成分，血中移行成分及代謝產物可能為生脈散的體內直接作用物質，對其進行深入的研究將有助於闡明生脈散的有效成分及作用機製。
1.4譜效關係結合法
中藥複方指紋圖譜是現代中藥質量控製的重要手段之一。中藥指紋圖譜的整體性和模糊性符合中藥質量控製的要求，較之單一化學成分的質量控製方法，更具有整體性和科學性。譜效關係是建立在指紋圖譜的研究之上，將標示活性成分群特征峰的中藥指紋圖譜與藥效結果對應起來，將中藥指紋圖譜中化學成分的變化與中藥藥效結果聯係起來，建立中藥譜效關係，表征中藥及中藥複方整體成分-配伍-藥效相關性的有效途徑，也為利用指紋圖譜優化處方、改進製劑工藝、追蹤分離目標活性成分、開發中藥新藥提出了新的思路和方法[10]。李鵬等[11]利用GC-MS建立桃紅四物湯低極性部位指紋圖譜，結合小鼠痛經模型，研究桃紅四物湯抑製小鼠痛經有效部位的譜效關係，結果表明亞油酸在延長扭體潛伏期和減少扭體次數方麵起主要作用，十八碳烯酸、花生酸、二十七烷對鎮痛效果有一定的協同作用。
1.5代謝組學研究法
代謝組學是以生物樣本為研究對象，以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與係統整合為目標的係統生物學的一個分支，是繼基因組學、轉錄組學、蛋白質組學後係統生物學的另一重要研究領域。它主要是應用現代分析儀器與分析手段，定性定量研究生物樣本包括生物體液（如血液、尿等）、細胞提取物、細胞培養液和組織等中的內源性代謝產物即代謝組。結合模式識別等化學信息學技術，分析生物體在不同狀態下的代謝指紋圖譜的差異，獲得相應的生物標誌物群，從而揭示生物體在特定時間、環境下的整體功能狀態[12]。於曉紅等[13]研究養心湯對不穩定型心絞痛（UA）患者血漿代謝組學的影響，結果表明神經酰胺、甘氨膽酸、別膽酸、石膽酸、白三烯B4可能是UA代謝組學標誌物，養心湯對UA患者血漿中的某些代謝產物或代謝通路可能有影響。鄒忠傑等[14]運用代謝組學方法研究角叉菜膠致大鼠足腫脹後的變化及雙黃連口服液發揮抗炎作用的相關代謝途徑，結果表明雙黃連口服液可以使角叉菜膠致大鼠足腫脹後發生紊亂的機體代謝回歸到正常水平。
代謝組學屬於新興發展的學科，對儀器設備要求比較高，目前該方法還尚未在中藥物質基礎研究中普及。
上述中藥複方的物質基礎研究方法可以看出，隨著時代進步與科學技術發展，中藥複方物質基礎研究的方法和手段也在不斷發展與創新。上述各種研究方法在揭示中藥複方內涵過程中起著並將繼續起著重要的作用。中藥複方是一個複雜的巨係統，必需耦合多學科知識與研究方法才能揭示中藥複方的科學內涵。
2基於體內外相結合的物質基礎研究思路
由於成分結構複雜多樣性與體內外多環節性決定了中藥大品種乃至中藥（複方）物質基礎研究過程中必需綜合多學科技術與理論。本文在此思想基礎上提出了“基於體內外相結合的中藥複方物質基礎研究思路”，建立了“以體內、體外研究相結合為前提，以成分轉移與轉變為基礎，以作用位點及效能為手段，以明確整方物質基礎為目的”的現代中藥複方物質基礎研究新模式。即通過現代分析技術結合體內外吸收代謝研究闡明中藥複方的化學成分組成結構及生物內環境對化學成分的影響；采用體內組織分布、生物色譜、酶與受體模型研究揭示中藥複方中與靶部位結合的化學成分類別；采用在體與離體模型研究篩選的物質基礎與原方對比驗證物質基礎篩選的正確性。此研究思路可以和代謝組學研究相互結合，分別從成分角度和生物體內環境的角度對中藥複方物質基礎進行揭示。
2.1中藥大品種體內外吸收代謝研究
中藥複方體內外吸收代謝研究主要是通過UPLC-Q-TOF-MS、快速全成分免疫芯片等現代分析技術結合體內外吸收代謝模型如Caco-2細胞模型、肝腸微粒體模型、腸道菌代謝模型、在體腸灌注模型和給藥後體內全成分分析等，研究中藥複方的化學成分組成及生物內環境因素對化學成分的影響。
2.1.1Caco-2細胞模型 Caco-2細胞模型是一種人克隆結腸腺癌細胞，結構和功能類似於分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結構。同時，存在於正常小腸上皮中的各種轉運係統、代謝酶等在Caco-2細胞中大都也有相同的表達，如細胞色素P450同工酶、穀氨酰胺轉肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶及糖、氨基酸、二肽、維生素B12等多種主動轉運係統在Caco-2細胞中都有與小腸上皮細胞類似的表達。Caco-2細胞模型是最近十幾年來國外廣泛采用的一種研究藥物小腸吸收的體外模型，具有相對簡單、重複性較好、應用範圍較廣的特點。
周惠芬等[15]研究養陰通腦顆粒主要有效部位在Caco-2細胞模型的吸收特性和轉運機製，結果養陰通腦顆粒中黃芪甲苷、川芎嗪和葛根素吸收均較差，且葛根素>川芎嗪>黃芪甲苷，黃酮、皂苷和生物堿的相互配伍對黃芪甲苷的外排作用明顯，對川芎嗪和葛根素的吸收轉運影響不明顯。黃芪甲苷、川芎嗪和葛根素在其轉運途徑中可能受到了小腸頂側膜的轉運蛋白的外排作用。吳青青等[16]考察羊藿三七提取物中主成分淫羊藿苷的腸吸收情況，結果表明淫羊藿苷的吸收較差，但羊藿三七提取物及淫羊藿提取物中的某些成分能抑製外排泵對淫羊藿苷的外排作用，從而有利於淫羊藿苷的吸收。韓天嬌等[17]利用Caco-2細胞單層模型考察附子中烏頭類生物堿提取物的跨膜轉運，結果表明加入配伍藥材後附子中11種二萜類生物堿的Papp發生了明顯的變化。幹薑、甘草和半夏水提物的加入能夠明顯地降低二萜類生物堿在小腸中的生物利用度，尤其抑製其中毒性較大的雙酯型生物堿的生物利用度；而浙貝母的水提物卻在促進吸收和抑製外排2個方麵共同作用，使二萜類生物堿的生物利用度明顯增加。
2.1.2肝、腸微粒體模型肝腸微粒體通過自身所表達的藥物代謝酶氧化和還原代謝多種藥物、前毒物、前致癌物等外源性物質，由此影響藥物的代謝和生物利用度，對口服藥物的毒性和療效以及藥物與藥物、藥物與食物的相互作用有潛在的影響。因此肝腸微粒體可用於體外藥物代謝、對藥酶的抑製及體外代謝清除等方麵的研究。
肝腸微粒體體外溫孵實驗是采用差速離心法從肝髒、小腸組織中提取的微粒體，並加入還原型輔酶II（NADPH）再生係統，在體外模擬生理環境下進行代謝反應，采用高效液相色譜（HPLC）、高效液相色譜質譜聯用（HPLC-MS）等測定方法對原型藥及代謝產物進行測定的一種體外代謝的實驗方法。
Zhang等[18]利用體外大鼠肝微粒體與鉤吻素子進行體外共孵育，得到了4個代謝物，通過MS，1D/2DNMR等分析方法進行結構確認，揭示了鉤吻素子體內代謝路徑。Tian等[19]以士的寧和馬錢子堿為指標研究馬錢子總生物堿在大鼠肝微粒體作用下的代謝，結果鑒定31個代謝產物，其中26個代謝物為首次報道。馬錢子總生物堿的生物轉化包括羥基化、N-氧化、環氧化、甲基化、脫氫、脫甲氧基化、O-去甲基化，以及水解反應。Song等[20]利用人及大鼠肝微粒體及腸道菌研究卵葉遠誌中成分卵葉遠誌口山酮F及其苷元的代謝，結果表明在人及大鼠肝微粒體中主要發生Ⅱ相代謝，而在腸道菌中卵葉遠誌口山酮F發生Ⅰ代謝產生5個代謝產物，而苷元幾乎沒有代謝產物產生。Ma等[21]研究了吳茱萸對黃連藥動學的影響，在體外利用大鼠肝微粒體研究UGT1A1表達，結果表明通過預處理吳茱萸減少了黃連生物堿的全身分布，主要是由於吳茱萸增加了黃連生物堿的吸收和Ⅰ相代謝，同時誘導了肝髒UGT1A1的表達。
肝腸微粒體體外溫孵法較其他的體外代謝方法以其酶製各技術簡單，代謝過程快，結果重複性好，易大量操作，便於積累代謝樣品供結構研究，實際工作中應用較為普及。
2.1.3腸道菌群模型傳統上中草藥的使用，絕大多數以方劑的形式通過口服吸收而發揮作用，藥物中的有效成分在進入腸道之後不可避免地與腸道菌群發生關聯，某些成分經相應細菌的作用發生代謝轉化後被吸收，較少部分的成分則以原型藥物直接被吸收，在肝髒解毒後經膽汁排泄，與腸道菌群接觸發生結合、裂解等代謝轉化再次被吸收。體內環境中腸道菌群是完成中藥有效成分代謝的重要因素之一。
將含有細菌的人、小鼠或其他動物的新鮮糞便或消化道內容物與藥物混勻，37 ℃厭氧培養，應用LC-MS，GC-MS等現代分析技術檢測藥物原型及其代謝產物的種類和量[22]。Wang等[23]研究葡萄籽中的酚類化合物的吸收和轉運，發現腸道菌作用下的酚類化合物產生了2個代謝產物能通過Caco-2單細胞層，而胃液和胰腺消化液都不能。Kim等[24]研究人參皂苷等多種天然活性成分在腸道菌代謝物的活性，結果顯示經過代謝的成分比原成分顯示更強的活性，揭示腸道菌群可以激活中藥中的藥理活性，是中藥成分向活性成分轉化的生物催化轉化器。Wan等[25]研究人腸道菌群對西洋參的代謝作用，結果表明共25個代謝產物被檢測出來，其中13個成分可以用對照品進行對照，並確定了另外的12個成分。4個最豐富的代謝產物是20S-人參皂苷，人參皂苷Rg3，F2和Compound K。人參皂苷的主要代謝途徑是通過逐步裂解糖基，腸道菌群去糖基化反應伴隨的脫水反應。原人參二醇和齊墩果烷型三萜類化合物很容易代謝。腸道菌群在西洋參代謝活性中發揮了重要作用。