指紋圖譜分析結合多指標成分定量用於六味五靈片的質量評價
製劑與炮製
作者：劉宏明 徐楠楠 聶磊
[收稿日期] 2013-12-09
[基金項目] 山東省自然科學基金項目（ZR2011HM080）
[通信作者] *劉宏明，主管中藥師，主要從事中藥質量的檢驗分析工作，Tel：（0533）3571051，E-mail
[摘要] 采用反相高效液相色譜法-二極管陣列檢測器，以乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫，對20批六味五靈片中的6種成分進行同時分析測定，並對其指紋圖譜進行研究。結果表明6種成分（特女貞苷、連翹苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素）分離良好，加樣回收率在98.96%～100.5%，RSD小於2.0%；在特征指紋圖譜研究中，以五味子酯甲為參照峰，共標定了25個共有峰，采用夾角餘弦法、相關係數法、等權比率法對指紋圖譜進行了相似度分析，分析的20批六味五靈片與共有模式之間具有良好的相似性，相似度均在0.95以上。G檢驗及聚類分析結果表明所建立的含量測定結合特征圖譜分析方法可用於六味五靈片的質量控製。
[關鍵詞] 六味五靈片； HPLC； 指紋圖譜； 質量評價
六味五靈片由五味子、女貞子、連翹、莪術、苣蕒菜、靈芝孢子粉組成，具有滋腎養肝、活血解毒的功能，主要用於治療慢性乙型肝炎，獲“中國肝類用藥市場十大影響力品牌”稱號，為山東世博金都藥業有限公司獨家品種。六味五靈片中含有的多種成分都具有良好的抗炎、抗病毒、抗肝纖維化、保肝作用，如特女貞苷、連翹苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素[1-5]。而原質量標準中隻有五味子甲素的含量測定，測定成分單一，難以全麵控製六味五靈片的質量。中藥指紋圖譜方法已廣泛用於中藥的質量控製[6-8]，這種方法所提供的色譜指紋特征信息比目前沿用的其他方法更加豐富、全麵。中藥複方製劑走向國際的前提條件之一就是需要應用色譜指紋圖譜，控製中藥複方製劑的質量[9]。因此本研究在建立六味五靈片主要指標性成分特女貞苷、連翹苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量分析方法的同時，還對20批六味五靈片進行了色譜特征譜的分析與探討，為六味五靈片的內在質量控製提供了一種較為全麵的分析手段。
1 材料
高效液相色譜儀（Agilent 1100型），包括DAD檢測器（美國Agilent 公司）；高效液相色譜儀（SHIMADZU），包括SHIMADZU LC-20ATVP 泵，SHIMADZU SPD-20AVP紫外檢測器，CTO-20A 柱溫箱，SIL-20A 自動進樣器；分析天平（METTLER AE 240）；超聲波清洗器（KS-300E）。
特女貞苷（批號111926-201203，純度96.4%），連翹苷（批號110821-201213，純度95.3%），五味子醇甲（批號110857-201211，純度99.9%），五味子酯甲（批號11529-200604，置五氧化二磷中減壓幹燥12 h以上，按100.0%計），五味子甲素（批號110764-201312，純度99.6%），五味子乙素（批號110765-200205，置五氧化二磷中減壓幹燥12 h以上，按100.0%計）對照品均來源於中國食品藥品檢定研究院。甲醇、磷酸為分析純，乙腈為色譜純，超純水為實驗室自製。20批六味五靈片樣品為市售，均為山東世博金都藥業有限公司生產。
2 方法
2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相0.1%磷酸（A）-乙腈（B），線性梯度洗脫程序：0～5 min，5% B；5～15 min，5%～18% B；15～28.5 min，18% B；28.5～50 min，18%～50% B；50～57 min，50%～55% B；57～67 min，55% B；67～72 min，55%～75% B；72～80 min，75%～85% B；80～90 min，85%～5% B。流速1.0 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；檢測波長230 nm。6種成分理論板數均不低於40 000。
1.特女貞苷；2.連翹苷；3.五味子醇甲；4.五味子酯甲；5.五味子甲素；6.五味子乙素。
2.2 溶液的製備
2.2.1 對照品溶液的製備 精密稱取特女貞苷對照品12.09 mg置10 mL量瓶中，加甲醇超聲處理使溶解，加甲醇稀釋至刻度，作為特女貞苷對照品貯備液（1.165 g·L-1）。同法分別精密稱取連翹苷對照品12.72 mg、五味子醇甲對照品10.58 mg、五味子酯甲對照品12.18 mg、五味子甲素對照品13.52 mg、五味子乙素對照品18.68 mg分別置10 mL量瓶中，加甲醇超聲處理使溶解，加甲醇稀釋至刻度，分別製成連翹苷（1.212 g·L-1）、五味子醇甲（1.057 g·L-1）、五味子酯甲（1.218 g·L-1）、五味子甲素（1.347 g·L-1）、五味子乙素（1.868 g·L-1）對照品貯備液。分別精密量取特女貞苷、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素對照品貯備液各2 mL、連翹苷、五味子乙素對照品貯備液各1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為混合對照品貯備溶液。精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對照溶液，分別含特女貞苷0.116 5 g·L-1、連翹苷0.060 61 g·L-1、五味子醇甲0.105 7 g·L-1、五味子酯甲0.121 8 g·L-1、五味子甲素0.134 7 g·L-1、五味子乙素0.093 40 g·L-1。另精密吸取五味子乙素對照品貯備液2 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為五味子乙素對照品貯備液2（含五味子乙素0.149 4 g·L-1）。
2.2.2 供試品溶液的製備 取六味五靈片20片，研細，精密稱取約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲提取30 min，放冷，再稱定，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。
3 結果
3.1 六味五靈片的含量測定
3.1.1 標準曲線的建立 分別精密吸取混合對照品貯備液0.2，0.5，1，2，3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別將此5種對照品溶液與混合對照貯備液及混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，進樣量均為10 μL，測定峰麵積。結果以峰麵積為縱坐標，進樣量（μg）為橫坐標，繪製標準曲線。