苦碟子注射液對缺血性腦卒中火毒證大鼠作用的差異蛋白質研究
藥理
作者：王鳳麗 張允嶺 劉雪梅 王新祥 鄭宏 張昕洋 高芳 姚婷
[收稿日期] 2014-01-09
[基金項目] 國家重點基礎研究發展計劃（973）項目（2012CB518406）；北京中醫藥大學創新團隊發展計劃（2011-CXTD-23）
[通信作者] *張允嶺，教授，主任醫師，博士生導師，從事中醫藥防治中風和老年期癡呆臨床及機製研究，Tel：（010）67689634，E-mail
[作者簡介] 王鳳麗，在站博士後，從事中醫腦病專業，E-mail
[摘要] 探討中藥苦碟子注射液對缺血性腦卒中火毒證大鼠腦組織蛋白質表達的調控作用。采用角叉菜膠複合大腦中動脈阻塞（MCAO）方法製備缺血性腦卒中火毒證大鼠模型，按隨機數字表法將SD大鼠分為藥物組、模型組和假手術組。采用TTC染色法和HE染色法對腦組織進行大體觀察和病理形態學觀察；利用雙向凝膠電泳技術尋找缺血性腦卒中火毒證大鼠和假手術大鼠之間與疾病相關的差異表達蛋白，並觀察應用苦碟子注射液連續幹預72 h後，對差異蛋白表達水平的影響。結果顯示，缺血性腦卒中火毒證大鼠與假手術大鼠間有差異表達蛋白，連續給予具有清熱解毒通絡作用的苦碟子注射液能夠減輕腦組織缺血形態學改變，調節部分差異蛋白表達水平。
[關鍵詞] 苦碟子注射液；缺血性腦卒中；火毒證；電泳；蛋白質組
腦卒中是一組突然起病，以局灶性神經功能缺失為共同特征的急性腦血管疾病，又稱為中風或腦血管意外，具有高發病率、高病死率、高致殘率等特點[1]。世界衛生組織調查結果顯示[2]：中國腦卒中發病率排名世界第一，比美國高出1倍。我國第3次國民死因調查結果也表明[2]，腦卒中已經升為中國第1位死因。其中以急性缺血性腦卒中最為多見，占全部腦卒中的60%～80%[3]，嚴重危害著國民健康和生命。本研究采用中藥苦碟子注射液對缺血性腦卒中火毒證大鼠進行幹預，並運用蛋白質組學方法，從整體蛋白質分子水平探討苦碟子注射液對腦組織蛋白表達的影響，尋找可能的治療靶點。
1 材料
1.1 動物
健康雄性SD大鼠36隻，體重240～260 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK（京）2012-0001。
1.2 藥物與試劑
苦碟子注射液由通化華夏藥業有限責任公司生產，批準文號國藥準字Z20025450；角叉菜膠（Carageenan， c1013）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為Sigma公司產品；蛋白Marker（SM1811）購自加拿大Fermentas公司；24 cm固相pH梯度（IPG）膠條（pH 3～10，NL）、硫脲、礦物油均為美國GE Amersham Biosciences產品；Bio-Lyte 3/10 Ampholyte為美國Bio-Rad公司產品；Protease Inhibitor、苯甲基磺酸氟（PMSF）、溴酚藍、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內鹽（CHAPS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、考馬斯亮藍G-250（CCB G-250）、二硫蘇糖醇（DTT）、低熔點瓊脂糖、甘氨酸（Glycin）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸氨、N，N，N′，N′-四甲基二乙胺（TEMED）、尿素、十二烷基磺酸鈉（SDS）、碘乙酰胺、甘油、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）均為Amresco公司產品；其餘藥品均為國產分析純試劑。
1.3 儀器
ELx800通用酶標儀（美國BioTek公司），VCX130PB超聲波破碎儀（美國Sonics公司），CP100WX高速冷凍離心機（日本日立公司），ULT-1386-3V超低溫冰箱（美國Thermo Scientific Revco公司），EttanIPGphorⅡSystem，Ettan Daltsix Electrophoresis System及EPS601 Power Supply（美國GE Healthcare公司），PowerLook 2100xl掃描儀（台灣UMAX公司），ASP300全封閉組織脫水機（德國LEICA），EG1150組織包埋機（德國LEICA），RM2265全自動半薄輪轉切片機（德國LEICA）。
2 方法
2.1 動物分組
隨機分為模型組、藥物組、假手術組，每組各12隻（課題組在前期工作中，已有研究結果表明[4]，苦碟子注射液能夠降低神經功能損傷評分，減輕腦組織缺血形態學改變，且中藥組苦碟子注射液對神經損傷的改善作用強於西藥組鹽酸法舒地爾注射。而本研究旨在尋找苦碟子注射液發揮腦保護作用的蛋白靶點，因此未設藥物對照組）。模型組和藥物組按照下述的角叉菜膠複合大腦中動脈阻塞（MCAO）方法製作缺血性腦卒中火毒證大鼠模型，假手術組大鼠除不阻塞大腦中動脈外（插線10 mm），其餘操作過程同模型組。
2.2 動物造模
3組大鼠均經腹腔注射角叉菜膠20 mg·kg·d-1，共3 d。模型組和藥物組再按照 Longa的方法略作改良製作大鼠左側大腦中動脈阻塞腦缺血/再灌注模型[5]。術前12 h禁食不禁水，按35 mg·kg-1水合氯醛腹腔注射麻醉後，仰臥固定於手術台，沿頸部正中切開皮膚，逐層鈍性分離肌群，暴露左側頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）及頸內動脈（ICA），結紮ECA 根部、CCA近心端，微動脈夾暫時夾閉 CCA 的遠心端，在 CCA 結紮上方剪一斜口，插入直徑0.24 mm 的尼龍線，使其頂端到達大腦前動脈（ACA）的起始處，從而閉塞大腦中動脈（MCA）起始處，造成 MCA 供血相關區的梗死，尼龍線平均插入深度為（18.5±0.5） mm，紮緊以固定尼龍線並防止出血，縫合皮膚，尼龍線末端暴露在體外。術後1.5 h拔出尼龍線，模擬腦缺血再灌注。假手術組大鼠除插線 10 mm 外，手術過程同上。大鼠醒後24 h內提起鼠尾離開地麵1尺左右，觀察兩前肢的伸展狀況；大鼠置於地麵，觀察其行走情況，如出現不能完全伸展右前肢，或者向右側旋轉，或者行走時向右側傾倒為模型製作成功。實驗過程中，模型組大鼠有2隻死亡，藥物組大鼠有1隻造模不成功，均予剔除，共計33隻大鼠完成實驗。
2.3 給藥方法
藥物組腹腔注射苦碟子注射液8.4 g·kg·d-1，餘2組分別腹腔注射同等量生理鹽水，於術後當天給藥1次，共4次，至造模成功後72 h。
2.4 取材及指標檢測方法
腦缺血1.5 h再灌注72 h後分別留取待測組織。
2.4.1 大體觀察 腦組織TTC染色：將大鼠快速斷頭取腦，在-20 ℃冰箱冷凍20 min，當腦組織冷凍到一定硬度後取出，用刀片去除嗅球和低位腦幹，然後自額極開始沿冠狀麵行2 mm厚切片，共5片。將切好的腦片參照“夾心TTC染色法”[6]進行染色，15 min後取出，用數碼相機進行拍照。
2.4.2 病理形態學觀察 HE染色：將大鼠應用多聚甲醛溶液灌注固定後取腦，再置於其中進行後固定，24 h 後，將大腦自額葉至枕葉做等距離的 A，B，C，D，E 5個冠狀切片，取C切片，進行乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋後，製成5 μm厚度的冠狀麵石蠟切片，常規HE染色後，行病理學檢查，光鏡下觀察腦組織形態學改變。
2.4.3 雙向凝膠電泳（2-DE） 將大鼠快速斷頭取腦，留取大鼠病灶側梗死周邊區大腦皮層組織於液氮中速凍，再置於-80 ℃冰箱中保存。
蛋白質樣品製備：3組大鼠腦組織各約100 mg，分別置於研缽加適量液氮研磨後，在1 mL（5倍體積）的蛋白裂解液中用電動勻漿器進行勻漿，並將勻漿液在液氮中反複凍融3次，加入50 mg·L-1 Rnase及200 mg·L-1 DNase，放於4 ℃冰箱靜置30 min，繼以冰浴100 w，工作2 s，間歇2 s，22個循環進行超聲破碎，再以16 000×g，4 ℃離心40 min，取上清分裝，-80 ℃冰箱中保存備用。
蛋白質樣品純化：去脂蛋白純化法，參照文獻[7-8]，在蛋白樣品中加入10倍體積的預冷去脂蛋白純化液（磷酸三丁酯-丙酮-甲醇1∶12∶1 ），4 ℃靜置90 min後， 16 000×g，4 ℃離心20 min，棄上清，得到蛋白沉澱。再次加入去脂蛋白純化液，進行上述離心操作，棄上清，冷凍幹燥除去殘留的去脂蛋白純化液後獲得蛋白質幹粉。加入水化上樣緩衝液複溶蛋白，16 000×g，4 ℃離心40 min，取上清後分裝，采用Bradford法[9]測定蛋白質量濃度，其餘放置-80 ℃冰箱中保存。