2.5 標準曲線的建立
取2.2.1項下標準溶液血漿樣品，按2.3項下方法對血漿樣品進行處理，進樣測定。以被測物峰麵積與內標峰麵積的比值y為縱坐標，進樣質量濃度x（μg·L-1）為橫坐標，權重因子采用 1/x2進行線性回歸，得紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶線性回歸方程，分別為y=0.001 30 x+0.002 25（r=0.996 2）；y=0.007 48x+0.007 59（r=0.995 1）；y=0.000 89x+0.003 67（r=0.999 4）。紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶的線性範圍分別為3.00～
Ⅰ.大鼠空白血漿；Ⅱ.大鼠空白血漿加入內標及對照品； Ⅲ.大鼠尾靜脈注射液刺五加注射液15 min 後血漿樣品。
3 000， 3.00～3 000，1.00～1 000 μg·L-1。將標準曲線最低點連續進樣6針，確定最低定量下限處精密度及準確度。實驗結果表明，最低定量下限處精密度RSD≤14%，準確度RE≤12%，滿足方法學要求。
2.6 精密度與準確度試驗
取低、中、高3濃度的質控血漿樣品50 μL各6份，按2.3項下血漿樣品處理方法進行處理並進樣測定，連續測定3 d，與標準曲線同時進行，計算日內及日間精密度。結果顯示，該方法的精密度及準確度均符合藥代動力學方法學要求。
2.7 回收率與基質效應試驗
取50 μL大鼠空白血漿9份，分為3組，每組3樣本，分別加入100 μL乙腈沉澱蛋白，渦流混合1 min，於12 000 r·min-1條件下離心5 min，取全部上清液經氮氣吹幹。依次每組分別加入50 μL內標溶液，50 μL低、中、高3個質控濃度對照品混合溶液及50 μL 乙腈，經超聲、渦流、離心後，取上清液進樣測定，記錄被分析物及內標的峰麵積（用A表示）；另取50 μL大鼠空白血漿9份，分為3組，每組3樣本，依次加入50 μL內標溶液和50 μL 3質控濃度對照品混合溶液，按2.3項下處理方法處理，取上清液進樣測定，記錄被分析物與內標的峰麵積（用B表示）。計算B/A比值，得回收率。另取50 μL純水9份，分為3組，每組3樣本，加入100 μL乙腈渦流離心，氮氣吹幹後依次加入50 μL內標溶液和50 μL 3質控濃度對照品混合溶液及50 μL乙腈，超聲、渦流、離心後，取上清液進樣測定，記錄被分析物及內標的峰麵積（用C表示）。計算A/C比值，得基質效應，被分析物及內標的回收率>70%，滿足藥代動力學的方法學要求。血漿中基質對目標化合物具有微弱的離子增強作用，對內標化合物具有微弱的離子抑製作用，但並不影響該定量方法的準確性，可以忽略。
2.8 穩定性試驗
製備低、高質量濃度的含紫丁香苷（10.0， 2 700 μg·L-1）、刺五加苷E（10.0， 2 700 μg·L-1）及異嗪皮啶（3.00， 900 μg·L-1）的血漿樣品，將血漿樣品按如下方式處理，血漿樣品室溫放置4 h後按2.3項下方法處理，進樣分析； 將血漿樣品置於-20 ℃冰箱中冷凍保存32 d後，按2.3項下方法處理，進樣分析；將血漿樣品進行3次凍融循環後按2.3項下方法處理，進樣測定；將已處理的血漿樣品上清液置於進樣小瓶中放置12 h後，進樣分析，在上述4種不同的處理條件下，3個被分析物表現穩定。
2.9 藥代動力學試驗
24隻 Sprague-Dawley大鼠於給藥前禁食12 h，自由飲水。隨機分為4組，每組6隻。I組經尾靜脈
注射用生理鹽水配製的紫丁香苷溶液（140.2 mg·L-1），Ⅱ組經尾靜脈注射用生理鹽水配製的刺五加苷E溶液（130.2 mg·L-1），Ⅲ組經尾靜脈注射用生理鹽水配製的異嗪皮啶溶液（14.0 mg·L-1），Ⅳ組經尾靜脈注射刺五加注射液（按10 mL·kg-1體重給藥）。分別於給藥後2，5，10，15，20，30，40，60，90，120，150，180 min 眼底靜脈叢取血約300 μL，置於肝素抗凝管中。經8 000 r·min-1離心5 min後取上層血漿，-20 ℃冰箱冷凍保存，已備測定。
2.10 數據分析及結果
采用LC-MS/MS測定不同時間點的大鼠血漿中被測物的濃度繪製得到的血藥濃度-時間曲線。選用DAS 2.0軟件的非房室模型計算主要藥代動力學參數。血藥濃度-時間曲線下麵積（AUC）采用線性梯形法則進行計算實驗結果顯示，大鼠尾靜脈注射刺五加注射液後，紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶的AUC0-∞分別為（721.0±81.8），（984.1±167.3），（23.4±9.1） μg·h·L-1； 消除半衰期（t1/2）分別為（0.6±0.1），（0.7±0.5），（0.13± 0.02） h。采用SPSS 17.0對數據進行正態性分析後，以P[11]及刺五加注射液中紫丁香苷、刺五加苷E在大鼠體內的藥動學行為、組織分布特性[10]已有報道， 對於有效單體成分與刺五加注射液在大鼠體內的藥動學比較未見報道。本課題組首次以紫丁香苷、刺五加苷E和異嗪皮啶為指標成分對刺五加注射液的大鼠體內藥動學行為進行表征。同時靜脈給予單體有效成分，與給予相同劑量的刺五加注射液在大鼠體內主要藥動學行為進行比較。
實驗結果表明，在同等劑量下，單體成分與刺五加注射液的多個藥動學參數存在顯著性差異。注射液組紫丁香苷的AUC明顯高於單體用藥組，CL明顯低於單體用藥組。相反，注射液組刺五加苷E的AUC低於單體用藥組，CL高於單體用藥組。注射液組異嗪皮啶的AUC及CL均與單體用藥組無差異，t1/2及MRT較單體用藥組顯著延長。研究發現[12-13]，紫丁香苷、異嗪皮啶可通過疏水作用與血漿蛋白結合，因而推測刺五加注射液中共存成分可能通過改變該結合作用從而影響紫丁香苷及異嗪皮啶在大鼠體內的分布與消除過程。此外， 藥物經靜脈注射後隨血液循環到達身體各個部位，各有效成分可在體內發生代謝轉化，刺五加注射液中的共存成分可能通過改變這3個有效成分在大鼠體內的代謝轉化而影響其藥動學特征。刺五加注射液中的共存成分對不同有效成分在生物體內的分布、代謝或消除產生不同的影響，表現為紫丁香苷在大鼠體內蓄積增加，刺五加苷E消除增加，異嗪皮啶消除半衰期延長。至於注射液中的共存成分以何種機製及方式影響有效成分在生物體內的藥動學行為，有待進一步證實。
已有文獻報道[14-17]，中藥注射液或提取物中的有效成分與單體有效成分的藥動學過程存在顯著差異，本實驗為上述觀點進一步提供事實依據。鑒於中藥製劑成分複雜的特殊性，以其中的一種成分對其進行藥動學研究具有一定的局限性，不能完全反映中藥製劑的藥動學特點。本研究以刺五加注射液中的3種有效成分研究其在體內的藥動學，更具代表性和說服力，可以更好的指導臨床合理用藥。