1.3 組織指標測定
每組分別於造模後第7、14、28天隨機處死8隻小鼠，取肺組織病理切片行HE染色和Masson染色，觀察肺泡炎和纖維化程度；堿水解法檢測肺組織羥脯氨酸（HYP）含量；免疫組化法測定肺組織Ι型膠原、p-Smad3及p-JNK蛋白含量，各組進行對比。
1.4統計學方法
采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，P
2 結果
2.1 肺組織病理學改變
N組各時間點肺泡壁完整，肺泡腔大小均勻且無明顯滲出，偶可見少量炎細胞或成纖維細胞，支氣管壁完整；M組小鼠第7天出現明顯的肺泡炎，肺泡間隔增寬，肺泡間隔及肺泡腔內單核巨噬細胞增生，可見少量成纖維細胞增生，病灶內見肺泡萎縮，Masson染色藍染的膠原纖維表達量少；第14天炎症稍減輕，仍見少量炎症細胞的浸潤，包括少量中性粒細胞、單核巨噬細胞和淋巴細胞，可見成纖維細胞增多，肺泡間隔顯著增厚、增寬，肺泡壁、支氣管壁增厚，部分肺泡萎縮、閉合，Masson染色見藍染的膠原纖維表達量增多；第28天肺泡炎症程度明顯減輕，肺泡結構破壞嚴重，肺間質內見成纖維細胞大量增生，纖維化程度加重，Masson染色見藍染的膠原纖維表達增多。SB組、SP組鏡下觀察，各時間點炎症反應及纖維化程度均較M組減輕。
2.2肺組織羥脯氨酸含量的測定
N組羥脯氨酸有少量表達，其他各組羥脯氨酸的表達均隨時間延長而增加，第28天達高峰。第7天各組Hyp含量比較，差異有統計學意義，第14、28天M組、SB組、SP組較N組表達明顯增多，SB組、SP組較M組表達明顯減少，組間比較差異有統計學意義（P
2.3 肺組織p-JNK蛋白免疫組織化學結果
N組偶有少量陽性表達，主要見於肺泡上皮細胞及小氣道上皮細胞；M組主要見於支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞、小氣道上皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞及浸潤炎症細胞的胞漿、胞核，各時間點灰度值均較N組顯著降低，即p-JNK蛋白表達均較N組顯著增多，差異有統計學意義（P
2.4肺組織p-Smad蛋白免疫組織化學結果
N組偶有少量陽性表達，多見於肺泡上皮細胞及小氣道上皮細胞；M組多見於支氣管上皮細胞、肺泡上皮細胞、小氣道上皮細胞、平滑肌細胞、血管內皮細胞，巨噬細胞及浸潤炎症細胞的胞質、胞核陽性表達增多；各時間點p-Smad蛋白灰度值均較N組顯著降低，即p-Smad蛋白表達均較N組顯著增多，差異有統計學意義（P
2.5 肺組織Ⅰ型膠原免疫組織化學結果
N組各時間點呈弱陽性反應，主要分布於支氣管周圍、血管周圍及肺泡間隔處，灰度值最大（注：灰度值越大說明蛋白表達越少），即N組有少量I型膠原蛋白表達；其他三組第7天表達較N組分布明顯增加，但差異無統計學意義。第14、28天時在M組肺內分布迅速增加，呈條索狀、斑片狀分布，於肺泡間隔處增加最顯著，各時間點灰度值均較N組顯著降低，即M組各時間點I型膠原含量較N組顯著增加，差異有統計學意義（P
3 討論
肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種原因不明的慢性間質性肺疾病，以成纖維細胞增生和ECM過度分泌為主要病理特征，ECM分泌大量膠原以進行性積聚的方式逐漸破壞正常肺組織結構，最終形成肺纖維化[3]，其中FB轉化為肌成纖維細胞是這個過程中的關鍵，此後肌成纖維細胞能合成大量ECM，其主要成分為Ⅰ、Ⅲ型膠原，同時又能減少ECM的降解，使其發生過度沉積，導致肺纖維化的發生[4]。馬躍文[5]及Brown[6]等認為在纖維化的過程中，細胞外基質的主要成份Ⅳ、Ⅵ膠原等逐漸被Ⅰ、Ⅲ膠原和細胞纖連蛋白等取代，Ⅰ、Ⅲ膠原構成ECM的主要成份。在試驗中也發現，博萊黴素可誘導小鼠肺組織成纖維細胞增生，以Ⅰ型膠原增生為主，呈現時間遞增關係，第28天時達高峰，因此Ⅰ型膠原作為肺組織細胞中的主要膠原成分，成為評價博萊黴素肺纖維化模型的特異指標[7]。本實驗證明SB組、SP組ECM的I型膠原含量各時間點灰度值均較M組顯著減少；SB組I型膠原灰度值均較SP組顯著升高，Ⅰ型膠原蛋白分泌明顯減少，提示抑製這兩條通路均具有改善肺纖維化的作用。
轉化生長因子β1（transforming growth factor beta l，TGF-β1）目前被大多數學者認為是肺纖維化形成和發展的關鍵細胞因子[8，9]，對ECM的生成和沉積起調節作用，還可促進成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞是纖維化的主要成份，不僅增強膠原合成，且具有收縮性，使肺組織結構破壞[10-12]。TGF-β1通過多個信號通路發揮作用，Smad3是其下遊的重要信號分子之一，p-Smad3高表達與炎症纖維化的發展密切相關。TGF-β1表達上調，促進Smad3高表達，進而促進各種促炎因子分泌，加速炎症纖維化病變進程。本研究中M組Ⅰ膠原表達水平增高，膠原沉積明顯，與其相應的TGF-β1及其下遊的Smad3 mRNA表達水平增高；在特異性拮抗劑SB431542幹擾後，肺組織Smad3表達水平降低，Ⅰ膠原表達水平降低，膠原沉積減少，肺纖維化程度明顯降低。
JNK信號通路為TGF-β1下遊的另一重要信號轉導通路，TGF-β1誘導纖維母細胞增殖，轉化為肌成纖維細胞及ECM，如Ⅰ、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白（Fibronectin，FN）過度聚集的過程中起重要作用[13，14]。JNK的異常表達可影響TGF-β1的活性，進而改變纖維化的進程。本課題組前期研究曾提出，通過阻斷TGF-β介導的JNK信號轉導通路可以有效減輕肺纖維化的程度，本實驗也證明在JNK特異性拮抗劑SB600125幹擾後，小鼠肺組織p-JNK蛋白表達水平降低，Ⅰ型膠原表達水平降低，膠原沉積較M組減少，肺纖維化程度明顯降低。
JNK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的重要一員，其作為TGF-β1下遊的重要信號通路，參與調控許多細胞增殖、分化與凋亡。在體外TGF-β介導的細胞轉錄過程，JNK與Smad信號傳導通路相互依賴[15]，JNK可以通過磷酸化Smad3來增強Smad信號通路，同時，Smad通路通過增加JNK誘導的轉錄因子AP-1即c-jun的活性來增強JNK信號通路[16]。通過體外實驗研究表明：JNK信號通路在TGF-β誘導的鼠腹膜間皮細胞的上皮-間質轉化中發揮重要作用，可能是通過磷酸化Smad3實現的[17]。Velden JL研究表明[18]，在體外實驗，JNK通過磷酸化Smad3和增強其轉錄活性來促進TGF-β誘導的EMT，同時，JNK1能調節Smad3/4複合物的核轉運並增強Smad3與Smad4之間的交互作用。本實驗表明，在小鼠肺纖維化過程中，阻斷JNK及Smad信號通路，對改善肺纖維化均有一定程度的作用，其中Ⅰ型膠原作為反映肺纖維化程度的主要指標，JNK較Smad信號通路灰度值稍高，表明Smad致纖維化程度較JNK通路明顯。