蒙成藥中“地格達”類原料藥材的位點特異性PCR鑒別研究
蒙藥專題
作者：崔占虎等
[摘要] 該文選擇8種含有地格達類蒙藥原料藥材的蒙成藥為對象，首先對基原植物肋柱花和苦地丁樣品采用改良CTAB法提取其總DNA，使用psbA-trnH片段進行擴增、測序，與GenBank下載的8種蒙成藥中其他原料藥材psbA-trnH序列進行同源比對後根據其變異位點設計特異性鑒別引物。同時對8種蒙成藥進行總DNA的提取，並使用DNA純化試劑盒進行純化，通過PCR反應對葉綠體rbcL序列進行擴增，再分別選擇肋柱花和苦地丁鑒別引物進行擴增，並將擴增後的產物進行測序。所得序列校正、比對後，進行比對分析。結果表明，地格達-4湯、地格達-8散、地格達-4散中均含有原料藥材肋柱花，苦地丁特異鑒別引物擴增分析可以鑒定出利膽八味散、伊赫哈日-12和阿嘎日-35中含有苦地丁。該研究結果說明，位點特異PCR方法用於鑒定蒙成藥中原料藥材具有一定的可行性。
[關鍵詞] 分子鑒別；蒙成藥；“地格達”；位點特異性PCR
[Abstract] To explore a new method for identification of Mongolian patent medicine （MPM） by PCR amplification of specific alleles. Eight kinds of MPM were used to study the identification of ″Digeda″ raw materials. The total DNA of Lomatogonium rotatum and Corydalis bungeana samples were extracted through modified CTAB method， psbA-trnH sequence was amplified by PCR and sequenced directionally. Specific primer was designed. The DNA of 8 kinds of MPM also was extracted and purified by the commercial DNA purification kits. The rbcL and two pair of specific primers sequences were amplified. The specific amplified products were sequenced in forward directions. All specific sequences were aligned and were analyzed. The results indicated that L. rotatum can be identified by specific primers from Digeda-4 Tang， Digeda-8 San， Digeda-4 San， and C. bungeana medicinal materials can be identified by specific primers from Li Dan Ba Wei San， Yi He Ha Ri-12 and A Ga Ri-35. PCR amplification of specific alleles can stably and accurately distinguish raw medicinal materials in MPM.
[Key words] molecular identification； Mongolian patent medicine； ″Digeda″ medicinal plants； PCR amplification of specific allele
蒙醫藥學是祖國醫藥學及民族醫藥體係的一個重要組成部分，在維護人民群眾的健康事業中發揮著重要的、獨特的作用。據資料統計，經考證的蒙藥材共有1 340餘種，來源於植物類的蒙藥占到全部蒙藥材的70%以上[1]。“地格達”來自印度梵語音譯，蒙語為苦的意思。作為蒙醫常用藥之一，“地格達”類蒙藥已經具有一千多年的應用曆史，在蒙藥處方中常常作為主藥之一被使用[2]。這類蒙藥具有顯著的清熱解毒作用，在蒙醫臨床上主要用於治療肝膽係統疾病。
根據文獻記載和實際調查研究，使用地格達類蒙藥材作為原料生產的蒙成藥多達20餘種，如地格達-4湯、利膽八味散、壯西-21散、伊赫湯、給旺-9散等[3]。而由於內蒙古地區作為“地格達”類蒙藥使用的植物多達7科30餘種[4-6]。目前，一些地格達類蒙藥材產量很難滿足市場需求，市場供求矛盾日益尖銳。因此市場上流通的一些蒙成藥在原料投放上難免就會有混偽品摻入，這將嚴重影響其藥效和安全性。對於藥材的直接鑒定還需要具備豐富藥材鑒別經驗的人員才能夠準確的識別出正品和混偽品，而對於蒙成藥中原料藥材的準確鑒定更是困難，傳統方法的鑒別手段雖然占據主導地位，但仍受特異性不強、穩定性差、樣品用量大等特點製約。而理論上，采用DNA分子技術鑒定蒙成藥的方法可以不受蒙成藥中其他藥材的化學成分幹擾與影響，直接從基因水平提供鑒定依據，即使是沒有任何鑒別經驗的人員通過分子技術流程都能夠準確區分蒙成藥中原料藥材的正品及其混偽品。
截至目前，一些學者主要采用顯微和理化的方法對蒙成藥中地格達類原料藥材進行鑒別研究[7-11]。而使用DNA分子方法鑒別蒙成藥中地格達類原料藥材還暫無報道。前期本實驗室基於DNA條形碼技術對4種龍膽科“地格達”類蒙藥基原植物開展了鑒別研究工作，所得到的psbA-trnH序列為本研究提供了一定基礎[12]。本實驗通過采用位點特異性PCR方法對8種蒙醫常用的蒙成藥中肋柱花和苦地丁2種地格達類原料藥材進行鑒別研究，為這類蒙成藥的分子鑒別提供依據。
1 材料與方法
1.1 材料 肋柱花基原植物5株、苦地丁基原植物3株分別采自內蒙古錫林郭勒盟和呼倫貝爾盟；苦地丁藥材5批以及8種蒙成藥均購自市場、醫院或藥店。其中《衛生部藥品標準（蒙藥分冊）》中規定8種蒙成藥均含有肋柱花、苦地丁或地丁原料藥材，然而其中3種成藥商品購買時外包裝上未標記原料藥材。憑證標本保存於包頭醫學院，實驗材料采集及鑒定信息。