1.2 試劑 2×CTAB提取液，1×TAE緩衝液，瓊脂糖（Promega公司）；溴化乙錠（Fluka公司）；DNA Taq聚合酶（Takara公司）；2 000 bp DNA Marker（Takara公司）；DNA純化試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；牛血清白蛋白BSA S100（江晨生物）；聚乙烯吡咯烷酮 PVP40（江晨生物）；三氯甲烷，無水乙醇，異丙醇均為國產分析純。
1.3 儀器 PCR儀（ABI公司， 型號9700）；電泳係統（北京市六一儀器廠，型號DYY-12）；低溫冷凍離心機（德國Eppendorf， 型號5810R）；VORTEX-2 GENIE漩渦震蕩儀（Scientific industries 公司）；紫外凝膠成像分析儀（英國Syngene， 型號GBOXHR）；混合型球磨儀（德國Retsch，型號MM400）；微量移液器（德國Eppendorf）。
1.4 特異鑒別引物的設計 選擇通用引物psbA-trnH對肋柱花和苦地丁樣品進行擴增，測序，去除引物序列，然後使用BioEdit分析軟件進行分析、校對處理。同時從GenBank中下載8種蒙成藥中含有的除動物藥和礦物藥外其他原料藥材的psbA-trnH序列。為了評價參考序列的質量和準確性，對於來自不同學者提交的相同物種的參照序列進行ClustalW分析，比對結果表明，不同人提交相同物種的序列相似度為90%以上。在此基礎上，對於每個物種從中挑選一條可信序列作為參照序列與測得的肋柱花和苦地丁psbA-trnH序列進行ClustalW比對分析，找出肋柱花和苦地丁的穩定差異變異位點，進而篩選出肋柱花和苦地丁的特有變異位點，根據其變異位點利用Primer premier 5 軟件設計2對位點特異鑒別PCR引物（LR-F/R， CB-F/R），設計的2對特異引物擴增後片段大小分別為232，201 bp。
1.5 總DNA提取及PCR擴增 DNA提取：8種蒙成藥以及原料藥材或基原植物取適量的樣品，研磨破碎裝入2.0 mL微量離心管中，采用改良CTAB法提取原料藥材的總DNA。
DNA純化：分別將提取後的蒙成藥總DNA使用DNA純化試劑盒進行純化，純化後的DNA置於-20 ℃備用。
PCR擴增：原料藥材或基原植物反應體係總體積為20 μL，包括10×buffer緩衝液2 μL，dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL（psbA/trnH），EX Taq 0.2 μL，DNA 0.5 μL，滅菌蒸餾水14.7 μL。8種蒙成藥擴增體係總體積仍為20 μL，其中減少滅菌蒸餾水的體積，加入BSA 0.5 μL，PVP 1 μL。引物使用通用引物rbcL（1F/724R）。各對引物PCR反應條件。反應結束後在PCR體係中加入5 μL 6×loading buffer，混勻後於EB染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像係統觀察、成像。
1.6 位點特異性PCR鑒別8種蒙成藥中地格達類原料藥材 取8種蒙成藥樣品DNA進行位點特異PCR反應，反應體係為10×buffer緩衝液2 μL， dNTP 1.6 μL，引物各0.5 μL（5 pmol·L-1）， EXTaq酶0.2 μL （5 U·μL-1），DNA 0.5 μL，滅菌蒸餾水14.7 μL。PCR反應程序。反應結束後在PCR體係中加入5 μL 6×loading buffer，混勻後於EB染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像係統觀察、成像。
2 結果
2.1 8種蒙成藥DNA 提取與PCR成功率 電泳檢測結果表明8種蒙成藥DNA條帶較弱，暗示該DNA的濃度較低。但利用該DNA進行通用引物rbcL（1F/724R）PCR反應，5種蒙成藥的PCR擴增產物經電泳後均可顯示出較亮條帶，而另外3種蒙成藥PCR擴增產物經電泳後均顯示較弱的條帶。結果顯示，采用的改良CTAB法提取8種蒙成藥的總DNA可成功用於成藥的分子鑒別。
2.2 蒙成藥中肋柱花原料特異性鑒別 將8種蒙成藥DNA作為模板，利用肋柱花特異引物LR-F/R進行PCR擴增，反應結束後在PCR體係中加入5 μL 6×loading buffer，混勻後於EB染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像係統觀察、成像。檢測結果表明， 3種中成藥（MPM01，MPM02，MPM03）在以上PCR反應條件下均可以穩定的擴增出232 bp條帶，而其他蒙成藥都未檢測到特異條帶。 擴增後的PCR產物進一步測序，所得序列去除引物序列後，並在GenBank數據庫中進行BlastN分析，與報道的肋柱花序列（GenBank number： HM460865）相比，所測序列的Maximum identity均為100%， E-value等於1e-92。結果表明MPM01 和MPM03 與衛生部藥品標準（蒙藥分冊）中描述相一致，而MPM05在標準中描述有肋柱花，卻沒有檢測到；相反，MPM02被描述原料中本不應該存在肋柱花，本實驗卻檢測到肋柱花存在[2-3]。
2.3 蒙成藥中苦地丁原料特異性鑒別 將8種蒙成藥DNA作為模板，利用苦地丁特異引物CB-F/R進行PCR擴增，反應結束後在PCR體係中加入5 μL 6×loading buffer，混勻後於EB染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，SYNGENE凝膠成像係統觀察、成像。檢測結果表明， 3種中成藥（MPM04，MPM07，MPM08）在以上PCR反應條件下均可以穩定的擴增出201 bp條帶，而其他蒙成藥都未檢測到特異條帶。 擴增後的PCR產物進一步測序，所得序列去除引物序列後，與本實驗中測得的苦地丁序列相比，所測序列的Maximum identity均為99%以上。本實驗結果表明MPM04 and MPM07與衛生部藥品標準（蒙藥分冊）中描述相一致，MPM02和MPM06在標準中描述有苦地丁卻沒有檢測到，說明在MPM02 和MPM06中可能不存在苦地丁原料藥材。相反，MPM08被描述原料中本不應該含有苦地丁藥材，標準中規定原料為地丁，卻檢測到苦地丁存在。