1.2 序列特征與進化樹分析 采用在線工具Protparam預測基因編碼蛋白的理化性質；分別采用ExPASy PROSITE和Interpro進行蛋白質結構域分析；采用CFSSP進行蛋白質二級結構分析。利用SinalP4.0Server進行分泌蛋白預測；利用WOLF PSORT進行蛋白定位信號預測。
1.3 係統發育分析 使用Clustal W 和MEGA 5.0的鄰接法（Neighbor-joining）進行係統發育分析，bootstrap值設置為1 000。
1.4 RNA提取和cDNA合成 用Invitrogen公司的Trizol reagent提取樣品總RNA，利用紫外分光光度儀測定總RNA的A260 nm，A280 nm。選擇A260nm/280nm為1.8～2.0的總RNA進行反轉錄，反轉錄反應按cDNA合成試劑盒（TaKaRa公司）說明書進行。
1.5 實時熒光定量PCR分析 利用軟件Primer Premier 5設計Real-time PCR引物。擴增產物的長度在100～250 bp。反應體係參照SYBR Premix Ex TaqTM Kit說明書，以LH18S作為紅腺忍冬L. hypoglauca基因表達分析的內參，設置重複3次。通過熔解曲線分析對擴增的特異性進行評估，使用7500軟件V2.0.1（ABI，USA）比較Ct法來確定基因的相對豐度。PCR反應使用的各基因引物。
2 結果與討論
2.1 預測新基因的特征 本研究以忍冬蛋白序列作為源序列，應用BLAST 軟件搜索紅腺忍冬基因組數據庫，共獲得4個新的同源基因LHPAL4，LHHCT1，LHHCT2，LHHCT3，所獲得序列被提交到GenBank數據庫，其中LHPAL4基因的氨基酸長度為449個氨基酸、相對分子質量為49.9 kDa、等電點為5.78，亞細胞定位於葉綠體，其編碼的蛋白為分泌蛋白，並含有結構域phenylalanine/histidine ammonia-lyase。LHHCT1基因的氨基酸長度為280個氨基酸、相對分子質量為31.2 kDa、等電點為6.5，亞細胞定位於細胞質；LHHCT 2基因的氨基酸長度為443個氨基酸、相對分子質量為49.5 kDa、等電點為6.36，亞細胞定位於葉綠體；LHHCT3基因的氨基酸長度為442個氨基酸、相對分子質量為49.4 kDa、等電點為6.02，亞細胞定位於細胞質；LHHCT1，2，3基因編碼的蛋白均為非分泌蛋白，且含有相同的結構域chloramphenicol acetyltransferase-like。
2.2 係統進化分析 本研究從NCBI的Nr數據庫中分別選取水稻、擬南芥和葡萄中已知功能的PAL進行LHPAL基因家族成員的係統進化分析，結果表明在4個紅腺忍冬PAL基因中LHPAL4和LHPAL1關係較為密切，且與雙子葉植物葡萄VvPAL關係相對密切。
莽草酸、奎尼酸羥基肉桂酰基轉移酶（HCT）和奎尼酸羥基肉桂酰基轉移酶（HQT）均為羥基肉桂酰轉移酶[8]。HCT是在綠原酸的生物合成途徑中表現出催化莽草酸、奎尼酸與咖啡酰基- 輔酶A酯化活性生成綠原酸的酶[9]。對-香豆酰輔酶A在HCT的催化下，形成C3H的底物對-香豆酰莽草酸/奎寧酸；同時HCT又可將C3H的催化產物咖啡酰莽草酸/査寧酸進一步轉換成咖啡酰輔酶A。HCT的底物可以是莽草酸或奎寧酸，具有莽草酸羥基肉桂酰轉移酶（shikimate hydroxycinnamoyl transferase， CST）和奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶（quinate hydroxycinnamoyl transferase，CQT）的雙重活性[10]。HQT是在綠原酸的生物合成途徑中表現出催化奎尼酸與咖啡酰基-輔酶A酯化活性生成綠原酸的酶。HQT的底物是莽草酸，隻具有奎寧酸羥基肉桂酰轉移酶的活性。由於HCT與HQT同屬羥基肉桂酰轉移酶，因此選取水稻、擬南芥和葡萄中已知功能的HCT進行LHHCT基因家族成員的係統進化分析，結果表明LHHCT1，LHHCT3，LHHQT2聚為一類，而LHHCT2單獨聚為一類，並與雙子葉植物水稻OsHCT關係較為密切，提示該基因可能具有獨特的功能。
2.3 LHPAL4蛋白特性及表達模式分析 由於LHPAL4是從紅腺忍冬中獲取的一個同源基因，利用BLASTX和ORF Finder預測其含有一個完整的開放閱讀框。序列比對分析結果表明，LHPAL4與LHPAL1，LHPAL2，LHPAL3的核苷酸序列同源性分別為48.39%，27.78%，47.46%；氨基酸序列同源性分別為8.57%，7.18%，7.38%。利用 CFSSP 軟件對 LHPAL4 蛋白的二級結構進行預測， LHPAL4蛋白殘基組成為α-螺旋（H） 為71.3%、β-折疊 （E） 為41.6%、β-轉角 （T） 為12.2%。
為了進一步分析LHPAL4的基因表達模式，本文比較了LHPAL4基因在紅腺忍冬葉、花蕾及敗花中的轉錄水平。結果表明，LHPAL4在3種器官中的表達量為敗花>葉>花蕾，其與LHPAL1的表達模式略有差異[5]。鄧玲姣、周曉舟等[11-12]認為綠原酸在紅腺忍冬花蕾中的含量比葉中的低，結合已發表的結果[5]推測LHPAL4，LHPAL1基因可能共同參與紅腺忍冬中綠原酸生物合成。