1 材料
Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP221D電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-250DB數控超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q實驗室超純水係統（美國Millipore公司）。
山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸對照品（純度≥98%）購自四川成都普菲德生物技術有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。
枇杷葉、花、果實均采於安徽中醫藥大學西區校園內的同一株樹齡10年以上的枇杷樹；枇杷樹經本院中藥與資源教研室王德群教授鑒定為E. japonica；落葉收集前清掃樹下地麵；新鮮樣品即時60 ℃幹燥至恒重，冷藏保存備用。
2 方法和結果
2.1 枇杷物候現象觀察
在2012年9月至2013年9月，觀察長於校園內的枇杷樹，即時記錄萌芽、現蕾、開花、結果等物候現象的發生和時間，枇杷1年發生春夏秋冬4次萌芽，其中春秋兩季抽梢萌發較為旺盛；從現蕾到果實成熟要經曆約8個月時間。
2.2 樣品含水量測定
將部分采集樣品及時幹燥至恒重，由幹燥前後樣品質量，計算樣品含水量，考察幹物質積累，枇杷各器官含水量為果肉>花序>嫩葉>成熟葉>落葉；各器官含水量隨物候變化的波動範圍不大，成熟葉在果實膨大時的含水量較低，在花期含水量較高；提示果實膨大期成熟葉的幹物質積累較多。
2.3 三萜酸含量測定
2.3.1 對照品溶液製備 精密稱取山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸、熊果酸對照品各適量，置於5 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，搖勻。得每1 mL含山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸分別為0.261，0.599，0.174，0.876 mg 的對照品溶液。
2.3.2 供試品溶液製備[15] 取各樣品細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加乙醇25 mL，密塞，稱重；超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，用乙醇補足失重，濾過，即得。
2.3.3 色譜條件 參照文獻[16]條件稍作調整，色譜柱：Shim-pack CLC-ODS（M）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇-水-冰乙酸-三乙胺（265∶35∶0.1∶0.05）為流動相；流速 0.6 mL·min-1；檢測波長 210 nm；柱溫 20 ℃；進樣體積 20 μL。
2.3.4 色譜係統適用性試驗 取同一批枇杷葉樣品5份，按2.3.2製備供試品溶液，按2.3.3色譜條件進樣分析；考察山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸的理論塔板數（n）、與相鄰峰的分離度（R）以及含量測量的重複性（RSD）；精取對照品溶液1，5，10，20，30 μL，按2.3.3色譜條件進樣，以色譜峰麵積（Y）為縱坐標，進樣質量（X，μg）為橫坐標，繪製標準曲線，建立回歸方程，三萜酸對照品和枇杷各樣品色譜圖。結果表明所用方法和儀器具有良好的適用性。
2.3.5 含量測定 精密稱取各樣品粉末，按2.3.2製備供試品溶液，按2.3.3色譜條件進樣，測定山楂酸、科羅索酸、齊墩果酸和熊果酸色譜峰麵積，外標法計算含量，平行測定3次。
2.3.6 4種三萜酸在不同器官中的含量分布 計算各器官三萜酸含量平均值，枇杷葉、花及果肉中的含量分布。表明①三萜酸在葉、花、果肉和核間的分布為葉>果肉>花，果核中未檢出這4種三萜酸成分；②枇杷葉是三萜酸的主要存在部位；③在葉的不同生長階段三萜酸的含量變化為嫩葉
2.3.7 4種三萜酸在枇杷葉中的動態變化 落葉中三萜酸質量分數為17.8～26.2 mg·g-1，秋季萌芽（9月）時最高，春季萌芽（2月）、幼果期最低，平均值是23.2 mg·g-1；成熟葉中三萜酸質量分數為16.6～23.2 mg·g-1，在果實膨大時最高，果實成熟時最低，平均值是21.7 mg·g-1；嫰葉三萜酸質量分數為14.7～21.5 mg·g-1，在開花末期最高，果實膨大時最低，平均值是17.5 mg·g-1。不同物候枇杷成熟葉和落葉中4種三萜酸含量的動態變化。
2.3.8 不同發育生長階段枇杷葉4種三萜酸含量的動態變化 從觀察的枇杷物候中選取3個物候點：開花始期、果實膨大和萌芽（9月），考察落葉、成熟葉和嫩葉在相同物候點上三萜酸的積累變化，清晰可見三萜酸隨著枇杷葉的發育進程積累增加的變化。由嫩葉向成熟葉生長過程中科羅索酸積累迅速增加，山楂酸也增加明顯，由原本在嫩葉中低於齊墩果酸，到後來高於齊墩果酸；成熟葉走向衰老最終從樹上脫落下來，終止了維持其生命活動的營養物質輸入，此時三萜酸含量達到葉中的極大值。3個物候點不同生長階段的枇杷葉，在各三萜酸變化比例上表現出相近的狀態。
3 結論與討論
我國是世界上運用物候指示氣候和季節最早的國家，遠在2 000多年前，我國勞動人民就利用物候現象安排農時，積累了豐富的經驗。植物物候主要指自然界中反映各種植物發芽、展葉、開花、結實、落葉等現象，是植物、樹木本身生理特性和氣候、土壤等多種環境因素的綜合反映。在目前對中藥采收及藥效成分的動態積累研究中，通常隻以日期或日曆上節令為考察的時間節點，對於地域分布廣泛的藥用植物，難以獲得普適性規律[17]。本研究通過觀察枇杷物候1個年度的周期輪回，結合分析主要活性成分含量，提示依據物候現象，分析植物次生代謝成分的積累和動態變化，初步得出以下結論：① 在合肥安徽中醫藥大學西區校園內觀測到枇杷物候表現為1年間可見明顯4次萌芽，1次現蕾、開花和結果現象，落葉較多發生在春、秋兩季抽梢萌芽期間，其次是冬季，夏季較少發生樹葉脫落。② 成熟葉的幹物質積累在開花始期最低，在果實膨大時最高。③ 在枇杷葉不同生長階段三萜酸的含量變化為嫩葉