2.1.2 檢測條件及操作過程 在樣品池中注滿被滴定溶液（注射用益氣複脈溶液），恒溫至25 ℃，控製攪拌速率為300 r·min-1，待儀器自動平衡後，記錄60 s，分別滴定注射用益氣複脈溶液和葡萄糖溶液，連續滴定25滴，每滴4 μL，間隔時間為350 s。
2.1.3 數據處理 在滴定過程中，用Launch NanoAnalyzea軟件采集數據，滴定結束後，將實驗用樣品濃度輸入，Launch NanoAnalyzea 軟件自動對反應活性譜進行計算、擬合，可得到2種注射劑溶合的熱力學參數ΔH及平衡常數K，計算ΔG及ΔS[20]。
ΔS=-RTlnK
R為氣體常數，T 為絕對溫度。
2.2 HPLC-DAD 指紋圖譜檢測
2.2.1 供試品溶液的製備 注射用益氣複脈（凍幹）稀釋液製備：取注射用益氣複脈（凍幹）約1.2 g精密稱定，置10 mL量瓶中，用20%乙腈溶解並稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液S1。
注射用益氣複脈（凍幹）與鹽酸腎上腺素混合液製備：取鹽酸腎上腺素注射液2支，過0.22 μm微孔濾膜，濾液備用。分別取等體積S1與鹽酸腎上腺素溶液，混合，製成樣品S2。
注射用益氣複脈（凍幹）與葡萄糖溶液混合液製備：取葡萄糖溶液，過0.22 μm微孔濾膜，濾液備用。分別取等體積S1與葡萄糖溶液混合，製成樣品S3。
2.2.2 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長203 nm，流動相水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，0～10 min，80%～70% A；10～18 min，70%～69% A；18～30 min，69%～67% A；30～40 min，67%～55% A；40～50 min，55%～45% A；50～70 min，45%～10% A。
3 結果
3.1 ITC檢測
注射用益氣複脈（凍幹）與葡萄糖、鹽酸腎上腺素溶液的相容性與反應活性譜。曲線為注射用益氣複脈（凍幹）分別與2種注射劑滴定結果，為扣除滴定液與樣品池中溶媒（滅菌注射用水）相互作用產生的熱量，測定了鹽酸腎上腺素、葡萄糖溶液與無菌水的滴定反應。扣除背景信息後，對滴定峰進行積分，得到的滴定過程熱量變化圖譜。應用軟件對所得數據進行分析，2組注射劑混合液溶後的熱力學參數。
從反應活性圖譜可見，注射用益氣複脈（凍幹）與2種注射劑滴定產生的反應譜峰形有較大差異。其中與葡萄糖溶液滴定圖譜漸變性不強，放熱較少，平均每滴放出熱量約為40 μJ，提示YQFM與5%GS溶合過程中主要發生了物理反應。YQFM與鹽酸腎上腺素滴定過程中熱反應譜漸變性強，規律明顯，且熱量變化譜中每滴放出的熱量較多，均大於400 μJ，提示YQFM與YS滴定過程中可能有化學鍵的斷裂或生成。
可見，扣除滴定注射劑對溶劑的作用後，注射用益氣複脈（凍幹）與鹽酸腎上腺素或GS反應的ΔG均為負值，由此可以判斷2種注射劑與YQFM溶合時均發生了自發反應。公式（2）顯示ΔG由ΔH及-TΔS 2個因素決定，這2個因素對ΔG貢獻的大小決定了反應的類型。若|ΔH|>T|ΔS|，則該反應為焓驅動反應，即為化學反應；若|ΔH|
T|ΔS|，因此可以推斷這2種注射液溶合後，發生了化學反應，其物質基礎發生了改變。而注射用益氣複脈（凍幹）與葡萄糖溶液融合過程中|ΔH| 3.2 指紋圖譜檢測 3.2.1 注射用益氣複脈（凍幹）指紋圖譜穩定性、精密度和重複性試驗 取同一供試品溶液，分別於製備後0，2，4，6，8，24 h檢測指紋圖譜。另取此溶液連續進樣5次，檢測指紋圖譜。另取同一批樣品，平行製備供試品溶液5份，檢測指紋圖譜。結果表明，各色譜峰的相對保留時間和峰麵積的RSD均在3%以內，相似度均大於0.95，符合指紋圖譜的要求。 3.2.2 注射用益氣複脈（凍幹）與鹽酸腎上腺素配伍前後指紋圖譜分析 注射用益氣複脈（凍幹）與鹽酸腎上腺素混合後，譜峰變化較大，①個別譜峰相對峰麵積增加；②峰的數目發生了變化，有的譜峰消失，或有新的譜峰產生；由此推斷，注射用益氣複脈（凍幹）與鹽酸腎上腺素混合過程中發生了化學反應，原有的一些成分在反應過程中減少或消失，並產生了新的化合物。應用夾角餘弦法進行相似度分析，結果顯示，YQFM與5%GS溶合後與YQFM指紋圖譜相似度為0.94，而YQFM與YS溶合後與YQFM指紋圖譜相似度為0.77。可見YQFM與YS溶合後，使YQFM指紋圖譜發生了顯著變化，而5%GS與YQFM溶合後，圖譜沒有顯著改變。提示：YS可使YQFM化學成分發生變化。該研究結果也進一步驗證了ITC方法所得結果，顯示出ITC方法定性判斷的準確性及可靠性。 4 討論 本實驗以注射用益氣複脈（凍幹）為模式藥，應用ITC法分別考察其與鹽酸腎上腺素或葡萄糖溶液合用的相互作用，並以化學指紋圖譜進行佐證。ITC 法檢測結果表明，注射用益氣複脈（凍幹）與鹽酸腎上腺素之間發生了焓驅動反應，即發生了化學變化，其內在物質發生了質變；而注射用益氣複脈（凍幹）與葡萄糖溶液混合後，發生的反應為熵驅動反應，即物理變化，其有效成分並未改變。2組實驗的化學指紋圖譜與ITC 法檢測結果一致。 注射用益氣複脈（凍幹）組方主要由紅參、麥冬、五味子提取物組成，主要成分有人參皂苷Rb1，Rb2，Rb3，Re，Rf，Rg1等皂苷類成分，人參二醇，人參三醇[21]及五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素等木脂素類成分[22]。鹽酸腎上腺素為腎上腺素的鹽酸鹽，結構中含有不穩定的鄰位酚羥基。當YS滴定到YQFM水溶液中時，可以使人參皂苷中的糖苷鍵和五味子甲素中的甲醚鍵斷裂；之後葡萄糖的半縮醛和乙醇可能反應生成縮醛；此外，鹽酸腎上腺素中的鄰位酚羥基很容易和人參皂苷、五味子甲素等結構中的羥基形成氫鍵，產生熱量。但是由於分子間氫鍵形成所產生的熱量遠遠小於化學鍵的斷裂或生成，因此推測YS滴定YQFM產生的熱量變化，主要是基於化學反應產生的熱量變化。葡萄糖有船式和椅式2種空間異構體。5%GS中含有大量的羥基，可與皂苷形成氫鍵。但是由於空間位阻較大，限製了葡萄糖的結合位點和結合數目，所以熱量變化較小，而且由於該結合方式不穩定，所以相應的熱反應活性譜呈現明顯的波動趨勢[23]。 中藥注射劑成分大多源於天然物質提取物，並含有各種輔料，成分特別複雜，而現有的化學方法難以反映合用藥物間相互作用時所有的化學信息。ITC法可連續、動態的監測物質分子間相互作用的動力學過程，並可根據直觀的熱力學變化圖譜和多元參數擬合，在無須知道注射劑內在物質的具體種類和性質條件下，直接判別化合物相互作用的反應類型，適用於物質基礎不清，尤其是無對照品、或引起變化的成分無紫外吸收的藥物，能夠彌補化學方法無法檢定或檢定程序複雜的不足，且具有較好的普適性和反應監控的特點，因此，ITC法在中西藥注射劑聯合用藥安全性評價及藥物聯合使用評價中將發揮重要的作用。 [參考文獻] [1] 潘玲. 6種中藥注射劑在輸液中的不溶性微粒測定[J]. 中國藥房， 2008， 19（6）： 451. [2] 毛璐， 甄健存， 陳誌剛，等. 靜脈滴注藥物中不溶性微粒的考察[J]. 中國藥學雜誌， 2006， 41（1）： 45. [3] 李軍， 魏慶旺， 張鑒，等. 注射用奧美拉唑鈉溶液的穩定性考察[J]. 中國醫院藥學雜誌， 2005， 25（8）： 775. [4] 馬媛媛， 李雪寧. 丹參注射液與臨床常用注射液配伍的穩定性[J]. 中成藥， 2013， 35（4）： 705. [5] 茅誌安， 苗佩宏， 王林，等. 滅菌溫度、pH值、等滲調節劑對替硝唑注射液降解產物的影響[J]. 中國醫院藥學雜誌， 2000， 20（4）： 218. [6] 郭丹丹， 侯世祥， 毛聲俊，等. α-細辛腦乳液型與溶液型注射劑的體內藥動學和分布比較[J]. 中國中藥雜誌， 2008， 33（1）： 46. [7] 付秀娟， 朱大勝， 劉玉梅，等. 鹽酸法舒地爾與奧紮格雷鈉注射劑體外配伍穩定性考察[J]. 中國藥師， 2011， 14（6）： 827. [8] 何蕾， 王桂玲， 張強，等. 紫杉醇納米乳劑的體內外考察[J]. 藥學學報， 2003， 38（3）： 227. [9] Freire E， Mayorga O L， Straume M. Isothermal titration calorimetry[J]. Anal Chem， 1990， 62（18）： 950A. [10] 劉敏， 孫德誌， 林瑞森，等. 人血清白蛋白與季銨鹽雙子表麵活性劑的相互作用[J]. 化學學報， 2007， 65（2）： 123. [11] 徐香玉， 孫祥軍， 劉敏，等. 氧化苦參堿與牛血清白蛋白相互作用的熱力學研究[J]. 化學學報， 2009， 67（18）： 2155. [12] 任永申， 鄢丹， 張萍，等. 基於等溫滴定量熱法表征的紅細胞凝集反應熱動力學特性研究[J]. 化學學報， 2011， 69（8）： 875. [13] Pierce M M， Raman C S， Nall B T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions[J]. Methods， 1999， 19（2）： 213. [14] 宋熙熙， 邵爽， 雷群芳，等. 等溫滴定量熱法測定脲酶催化尿素水解反應動力學[J]. 浙江大學學報：理學版， 2009， 36（2）： 175. [15] 王冬冬， 孫德誌， 李林尉，等. 5-氟尿嘧啶與牛血清白蛋白的相互作用[J]. 物理化學學報， 2007， 23（10）： 1627. [16] Sigurskjold B W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry[J]. Anal Biochem， 2000， 277（2）： 260. [17] Ikenoue T， Lee Y H， Kardos J， et al. Heat of supersaturation-limited amyloid burst directly monitored by isothermal titration calorimetry[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 2014， 111（18）： 6654. [18] 薛立新， 王慧俐， 雷星，等. 注射用益氣複脈（凍幹）對慢性心力衰竭患者心功能及血漿腦鈉肽的影響[J]. 中西醫結合心腦血管病雜誌， 2014， 12（3）： 279. [19] 朱蓉祥， 韓清華. 注射用益氣複脈治療冠心病合並心力衰竭的療效觀察[J]. 中西醫結合心腦血管病雜誌， 2014， （6）： 669. [20] Hiroyasu O， Adrian V C， Dong X， et al. Strongest and most specific HIV-1 protease inhibitors have both strong enthalpy and entropy binding components[J]. Protein Sci， 2002， 11： 1908. [21] Shibata S. Chemistry and cancer preventing activities of ginseng saponins and some related triterpenoid compounds[J]. J Korean Med Sci， 2001， 16（Suppl）： S28. [22] Lu Y， Chen D F. Analysis of Schisandra chinensis and Schisandra sphenanthera[J]. J Chromatogr A， 2009， 1216（11）： 1980. [23] Paolantoni M， Sassi P， Morresi A， et al. Hydrogen bond dynamics and water structure in glucose-water solutions by depolarized Rayleigh scattering and low-frequency Raman spectroscopy[J]. J Chem Phys， 2007， 127（2）： 024504. [責任編輯 馬超一]