3.4 芍芎組分不同組成結構對缺氧損傷 HUVEC 細胞 Bcl-2，Bax 蛋白表達的影響 Na2S2O4誘導的缺氧損傷模型組細胞蛋白表達水平Bcl-2/Bax顯著低於正常對照組（P
4 討論
赤芍和川芎為臨床常用的活血化瘀藥，2味藥材中含有多種活性成分，如芍藥苷、氧化芍藥苷、阿魏酸、咖啡酸等[18-21]。多有文獻報道，這些活性成分具有不同程度的抗氧自由基、抗炎和抗細胞內鈣超負荷作用。本研究選擇赤芍和川芎中2大類組分，對其不同組成結構比例進行研究，最終篩選出赤芍總苷與川芎總酚酸結構比例為8∶2的最佳組分結構。
血管內皮細胞功能是導致心血管疾病的發生和發展的關鍵因素，內皮細胞處於缺氧狀態可導致大量活性氧的產生，並且加速細胞的凋亡速度，本研究采用Na2S2O4進行細胞缺氧模型的誘導，並通過MTT實驗對不同濃度的Na2S2O4誘導濃度進行摸索，最終篩選出最合適的造模濃度，模擬心肌缺血缺氧微環境，借此觀察不同組成結構下組分對缺氧損傷人臍靜脈內皮細胞的保護作用。
基線等比增減設計方法是一種適用於效應明確且隻含有2種藥物的中藥複方間的配比優化，即在原藥對中2種藥物的固有的比例為基礎，保證兩者的總量一定，其中一個藥材含量以10%～30%遞增或者遞減，另一個藥物含量則對應的以10%～30%遞減或者遞增，最後兩端為單純的2種藥物。該方法已經成熟應用於多個中藥小複方之間的配比優化[22]。均勻設計與正交設計法雖然是相對較為科學的配比設計方法，但兩者對於2個因素條件的篩選往往較不適合，均勻設計各試驗點高度分散，不具有整齊可比性不足。正交設計則因為其不存在最高量的上線，所以可能會出現效應最強即為各種比例均為最大時，而且實驗次數較多[23]。相比較而言，基線等比增減設計法可采用多指標優化和多維時間序列綜合處理信息，適用於中藥小複方配比優化篩選的設計。但是其存在的不足就是，隻能適用於效應明確並且直言有2種藥物或者組分的中藥小複方間的配比[24]。劉新軍等[24]曾采用基線等比增減設計和正交設計研究比較毛冬青總黃酮與總皂苷在不同配比下對短暫腦缺血動物模型的保護作用，通過係統對比分析實驗設計和結果，得出基線等比增減設計更適宜於2組分中藥配比研究的結論。
正常機體內存在著由一定活性的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）等構成的天然抗氧化係統，SOD能及時清除細胞內產生的氧自由基，從而維持機體內的氧平衡，其活性能夠直接反應機體的抗氧化能力[25]。乳酸脫氫酶（LDH）含量的多少可以體現細胞膜是否完整以及細胞受損傷和死亡的程度輕重，丙二醛（ MDA）是自由基脂質過氧化產物，其含量的高低可以顯示氧自由基水平和脂質過氧化的程度[26]。正常情況下一氧化氮（NO）可促進血管舒張，減少血栓的形成。但是高濃度的 NO 則會誘發明顯的細胞毒性，增高血管的通透性，進而導致血管壁損害[27]。本實驗結果顯示，細胞缺氧損傷後與空白對照組相比，細胞內SOD活力顯著性降低，MDA 含量顯著增高，LDH的含量也顯著增加，NO的釋放量明顯增大，導致細胞毒性。造模成功後進行細胞給藥，研究發現，芍芎組分能夠改善細胞的損傷狀態，各給藥組SOD活力增加，MDA 含量降低，LDH 含量降低，NO 的產生顯著減少，研究表明芍芎組分能夠通過減輕氧化損傷，緩解細胞的缺氧損傷，從而達到保護血管內皮細胞的目的，芍芎組分結構為8∶2時，對損傷細胞的保護最強。
Bcl-2為凋亡抑製因子，Bax為促凋亡基因，Bcl-2與Bax的比值決定了細胞凋亡的發生與否以及程度輕重。Bcl-2/Bax較高為抗凋亡作用，相反比值低則為促細胞凋亡作用。本研究通過Western blot檢測了各組細胞Bcl-2，Bax 2個蛋白的表達量來探究芍芎組分抗凋亡的作用機製，實驗結果表明，模型組細胞Bax蛋白表達量與正常組比較顯著增加，Bcl-2蛋白表達量與正常組比較顯著下降，Bcl-2/Bax顯著下降。經不同組成結構的芍芎組分處理後，與模型組相比，各組Bax蛋白的表達量均有不用程度的下調，Bcl-2蛋白的表達量上調，Bcl-2/Bax顯著升高，這說明芍芎組分能夠抑製細胞的凋亡，對缺氧損傷的HUVEC有一定的保護作用，且結構在8∶2下抗凋亡效果最明顯，與試劑盒結果相一致。
本研究提示，芍芎組分可以緩解HUVEC缺氧損傷，減輕氧化應激損傷，抑製細胞凋亡，對損傷細胞具有保護作用，並且芍芎組分中赤芍總苷組分與川芎總酚酸組分組分間的組成結構比為8∶2時作用效果最為明顯，這2個組分內的結構優化仍需進一步的研究。
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