赤芍總苷、川芎總酚酸組分組成結構對缺氧損傷人臍靜脈內皮細胞的影響
藥理
作者：顧俊菲等
[摘要] 目的： 研究赤芍總苷、川芎總酚酸組分不同組成結構對連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）誘導的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）缺氧損傷模型的保護作用，並參照基線等比增減法，設計不同組分組成結構，優化出最佳的組分結構。方法： 采用Na2S2O4體外誘導HUVEC，建立細胞損傷模型。采用MTT比色法測定細胞活力，試劑盒測定細胞內超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛（MDA）含量、乳酸脫氫酶（LDH）含量、一氧化氮（NO）含量，通過Western blot檢測了各組細胞Bcl-2，Bax蛋白的表達量。結果： 與模型組比較，赤芍總苷組分、川芎總酚酸組分不同組成結構可顯著提高SOD活力，降低MDA，LDH，NO含量（P
[關鍵詞] 赤芍總苷；川芎總酚酸組分；基線等比增減法；組分結構；缺氧損傷
[Abstract] Objective： To study the effect of different composition structures of total paeony glycoside（TPG） component and total phenolic acid of Ligusticum chuanxiong（TLPA） on sodium dithionite （Na2S2O4）-induced human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） hypoxic injury. The baseline geometric proportion was used to design different components structure. And then the best structure of components by cell injury model were optimized. Method： A HUVEC hypoxic injury model was established by being induced of Na2S2O4. Cell viability was measured by MTT colorimetric method， intracellular superoxide dismutase （SOD） activity， malondialdehyde（MDA）， lactate dehydrogenase（LDH） levels， nitric oxide （NO） contents were measured by kits. At last， Western blot analysis was used to detect the expression of two proteins， Bcl-2 and Bax. Result： Compared with the model group， TPG component， TLPA component at different composition structures can significantly increase SOD activity and decrease MDA， LDH， _disibledevent=0∶10），除空白對照孔外每孔均加入終濃度為20 μmol·L-1的Na2S2O4不完全培養基，於37 ℃，5%CO2條件的培養箱作用24 h後吸棄培養基，細胞給藥後5%CO2培養箱37 ℃培養24 h，吸棄上層培養基，用PBS清洗2遍，加入0.2 mL細胞裂解液破碎細胞，細胞培養板於冰上放置20 min，並間或用槍頭吹打，以使細胞破碎裂解充分，吸取細胞培養液，2 000 r·min-1離心10 min，收集上清液稀釋進行試劑盒檢測，每個樣本各取少量蛋白，稀釋一定倍數，用Brandford方法檢測蛋白濃度，根據製備的標準曲線求出每個樣本蛋白的最終濃度。按照劑盒說明書進行SOD，LDH活性和MDA，NO含量的測定，反應後讀取所需波長下的A。采用黃嘌呤氧化酶法（羥胺法）測定SOD活性、硫代巴比妥酸顯色法測定MDA含量、硝酸還原酶法測定NO含量。
2.4 芍芎組分不同組成結構對缺氧損傷 HUVEC 細胞 Bcl-2，Bax 蛋白表達的影響 細胞點板、給藥、裂解及蛋白定量處理步驟均同2.2項下操作。蛋白樣品煮沸變性，進行電泳分離，濃縮膠電壓為80 V，30 min 後，分離膠電壓調整至100 V，約90 min，電泳至溴酚蘭離膠底部約0.5 cm時停止，取出凝膠，置於轉移緩衝液中平衡15 min，按恒流200 mA通電，電轉移100 min進行轉膜，NC膜在5%脫脂奶粉封閉液中封閉（4 ℃，過夜），棄去封閉液，不洗。以1∶1 000 的比例稀釋一抗，與搖床4 ℃搖蕩孵育過夜，PBST 洗滌4次，每次10 min，以1∶5 000 稀釋相應二抗，室溫孵育4 h，PBST 洗膜 4 次，每次10 min，按0.1 mL·cm-2顯影液計算用量，將顯影液加於NC膜上，室溫放置1 min。用保鮮膜將膜包好（盡量避免氣泡），X線膠片曝光顯影。暗室中迅速將膜蛋白貼在X光膠片上曝光，洗片機中顯影、洗像。調整曝光時間，直至出現最佳條帶。
2.5 統計學處理 實驗過程中所產生數據均采用SPSS 16.0進行處理，並且各組間數據比較采用t檢驗，用±s表示，P
3 結果
3.1 MTT法篩選連二亞硫酸鈉的最佳造模濃度 在本實驗所擬定的濃度範圍內，細胞存活率隨著Na2S2O4濃度的增加，明顯呈下降趨勢。實驗研究表明，當Na2S2O4的濃度大於2 mmol·L-1時細胞MTT的A與對照組有顯著性差異（P
3.2 芍芎組分對HUVEC的體外毒性實驗 當細胞存活率大於95%時可認為藥物對細胞無毒性，MTT 結果表明，赤芍總苷濃度為2×10-4 g·mL-1時細胞存活率為（96.79±1.98）%，川芎總酚酸濃度為2×10-4 g·mL-1時細胞存活率為（95.01±2.98）%，綜合分析，故均選用2×10-4 g·mL-1作為後續實驗中的給藥濃度。本實驗所選取不同結構比例下的芍芎組分，其細胞的存活率均大於95%，與對照組生存率無顯著性差異，即在所選比例下，藥物對細胞均不顯示細胞毒性。
3.3 芍芎組分不同組成結構對缺氧損傷HUVEC氧化及抗氧化影響 細胞進行Na2S2O4 缺氧損傷造模後，模型組MDA，LDH，NO含量均顯著性升高（P