2.9 Western blot檢測AR，PSA蛋白的表達 取對數生長期的LNCaP細胞，分組及加藥同2.8項，於2%FBS RPMI-1640中培養24 h後，刮刀刮下細胞，預冷PBS洗1次，加含1%PMSF的裂解液充分裂解細胞，提取細胞總蛋白，或按照細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明分別提取細胞漿蛋白和核蛋白，4 ℃，12 000×g離心15 min，轉移上清。BCA法測定蛋白濃度，調整樣品至相同濃度，與5×Loading buffer混合，99 ℃蛋白充分變性10 min。取20 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉印蛋白至PVDF膜；TBS漂洗後在5%脫脂奶粉封閉液中室溫封閉1 h，按GAPDH（1∶1 000），AR（1∶2 000），PSA（1∶1 000）一抗孵育，4 ℃過夜；用TBST於室溫洗膜3次，每次10 min，加入IRDye 800CW anti-Rabbit IgG二抗（1∶15 000），室溫孵育1 h；用TBST於室溫洗膜2次，每次10 min，再用TBS於室溫洗膜1次，10 min；使用紅外激光成像係統掃描圖像，分析灰度，以目的蛋白/GAPDH表示各蛋白的相對表達強度。
2.10 統計學分析 各項實驗均重複3次，所有數據采用±s表示。運用Flowjo軟件分析流式細胞儀檢測數據，LI-COR Image Studio軟件進行Western blot結果的灰度分析，GraphPad Prism 5軟件作圖，SPSS 18.0軟件進行數據統計分析。符合方差齊性條件下，2組數據間比較采用獨立樣本t檢驗，多組數據間比較采用單因素方差分析。P
3 結果
3.1 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞抑製增殖的作用 采用MTT方法考察PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞增殖的影響，結果顯示180～1 440 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ作用於LNCaP細胞，隨濃度升高，細胞活力降低，與對照組相比，能顯著抑製細胞增殖，並且呈明顯的濃度依賴性；PC-SPES Ⅱ作用24，48 h的IC50分別是311.48，199.01 mg·L-1。360，720 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ隨作用時間的增加，均能顯著抑製細胞增殖（P
3.2 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞周期分布的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，240 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞的G2/M期有阻滯作用，作用0，12，24，48 h，G2/M期細胞比例分別為7.63%，10.23%，12.27%，13.30%，隨作用時間增加而升高，並呈一定的時間依賴性。同時與對照組相比，PC-SPES Ⅱ作用下G0/G1峰前出現了亞二倍體峰（Sub G1，即凋亡峰）， 作用0，12，24，48 h，Sub G1峰隨藥物作用時間的增加而升高，其中240 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ 作用LNCaP細胞48 h後，Sub G1峰最高，細胞比例為34.90%（P
3.3 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞凋亡的影響 采用Hoechst 33258染色，觀察PC-SPES Ⅱ作用下是否存在凋亡細胞形態。結果顯示，加藥24 h後，熒光顯微鏡下可見凋亡細胞形態，與對照組細胞核DNA為淡藍色均勻熒光相比，表現為細胞核DNA固縮，呈致密濃染的藍色熒光，或見碎片狀致密濃染明顯增多。進一步采用Annexin V-FITC/PI雙染，流式細胞儀檢測凋亡細胞的比例，發現LNCaP細胞在240，480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ作用24 h後，凋亡細胞的比例顯著增加，主要表現為早期凋亡的細胞比例升高，與空白對照組0.56%比較，分別上升至18.7%，35.3%。
3.4 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞分泌PSA的影響 LNCaP細胞是激素依賴性人前列腺癌細胞係，高表達AR和PSA，480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ作用於LNCaP能明顯降低細胞分泌PSA的水平，與對照組PSA 113.67 μg·L-1相比，作用48 h後PSA下降最明顯，濃度為15.71 μg·L-1（P
3.5 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞AR，PSA mRNA表達的影響 人工合成雄激素R1881誘導下，通過qRT-PCR的方法檢測PC-SPES Ⅱ作用LNCaP細胞24 h後AR，PSA mRNA表達的變化。結果表明，在25 μg·L-1R1881誘導下LNCaP細胞AR，PSA的表達均顯著升高，分別是空白對照組的1.3（P
3.6 PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞AR，PSA蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，在25 μg·L-1R1881誘導下，LNCaP細胞AR，PSA的蛋白表達顯著增高，25 μg·L-1R1881作用24 h後，AR，PSA的蛋白相對表達分別是空白對照組的2.0倍；在240～480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ的幹預下能抑製AR，PSA蛋白表達的上調，且呈劑量依賴性，這一結果與AR，PSA mRNA的表達變化相一致。此外，進一步考察了細胞漿和細胞核中AR，PSA蛋白表達的變化，結果顯示，25 μg·L-1R1881作用24 h後，與空白對照組相比，胞核內AR表達升高35%，胞質內AR表達降低34%，PSA表達是空白對照組的3.5倍；但在240 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ幹預下胞質、胞核內AR表達同時下調約30%，胞質內PSA下調32%，但對胞核內PSA下調作用不顯著，提示PC-SPES Ⅱ可能對AR的核轉位有抑製作用，阻斷AR與細胞核內DNA片段結合，調控下遊PSA基因，抑製PSA蛋白表達。
4 討論
前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性生殖係統最常見的惡性腫瘤[7-8]。雄激素受體（AR）在前列腺癌發生發展中起關鍵作用。AR屬於類固醇激素核受體轉錄因子超家族成員，AR在細胞質中與熱休克蛋白（HSP）結合，處於轉錄未激活狀態。當血清中的睾酮在5α-還原酶作用下轉變為二氫睾酮（DHT），DHT與AR結合，活化後的AR構象改變，從HSP解離下來，暴露核定位信號，由細胞質進入細胞核，這一過程即為AR核轉位。激活的AR入核後與雄激素反應元件（AREs）結合，並在多種轉錄因子的參與下，激活AR下遊的靶基因，其中包括前列腺特異性抗原（PSA）。PSA屬於人組織型激肽釋放酶（KLK）基因家族成員，PSA基因序列5′端上遊啟動子和增強子區域包含多個AREs，能與雄激素激活後的AR結合，誘導PSA蛋白表達，最後由前列腺上皮細胞特異性分泌進入血液。前列腺癌病人的血清PSA水平呈持續高表達，因此臨床上PSA一直作為診斷前列腺癌發生發展的血清標誌物[9-11]。
目前認為AR是前列腺癌病程演進過程中的核心調控因子，除手術治療和雄激素剝奪療法（ADT）等前列腺癌主要治療手段以外，AR靶向治療日益受到關注。AR過表達和AR分子的過度激活與PCa的發展密切相關[12-14]。另有文獻報道稱AR對PSA起正調控作用的同時PSA能反饋激活AR，是調控AR表達的活化因素，直接關係到前列腺癌的發展[15-16]，因此尋找靶向AR的藥物治療前列腺癌有一定的研究前景和應用價值。
本研究發現PC-SPES Ⅱ能顯著抑製LNCaP細胞增殖，阻滯細胞周期於G2/M期，誘導細胞凋亡，體外抑製LNCaP細胞的作用效果顯著。LNCaP細胞是來源於人前列腺癌淋巴結轉移灶的細胞，具有管腔上皮樣細胞特征，其表型為CK5-/CK8+/AR+/PSA+，研究表明AR對該腫瘤細胞有促進增殖的作用[17-18]。同時文獻報道稱AR信號參與調節多個與細胞凋亡相關的信號分子，包括p21，p53，Bcl-2，Caspase家族等，AR對PCa細胞凋亡主要表現為抑製作用，反之下調AR表達可誘導PCa細胞凋亡[19-20]。因此為了探討PC-SPES Ⅱ抑製LNCaP細胞增殖的機製，假設PC-SPES Ⅱ抑製LNCaP細胞增殖，阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡的作用與調控AR分子有關，本實驗進一步考察了PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞AR表達的影響。結果發現，通過25 μg·L-1人工合成雄激素R1881誘導LNCaP細胞高表達AR後，240～480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ能顯著下調AR的mRNA和蛋白表達，並能降低細胞核內AR表達，表明與雄激素結合後活化的AR減少，抑製AR由細胞質進入細胞核，即有抑製AR核轉位的作用，從而阻斷AR與細胞核內對應DNA片段結合，調控下遊周期和凋亡相關基因表達。這一結果提示PC-SPES Ⅱ抑製LNCaP細胞增殖的機製可能和阻斷AR信號，抑製AR核轉位有關。同時還發現240～480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ能明顯降低LNCaP細胞分泌PSA的水平，以及R1881誘導下PSA的mRNA和蛋白表達，因AR分子直接調控PSA的表達，這一結果驗證了PC-SPES Ⅱ對AR的抑製作用。