中藥複方PC—SPES Ⅱ抑製人前列腺癌細胞LNCaP增殖及其對AR， PSA表達的影響
藥理
作者：張碧嚴等
[摘要] 基於雄激素受體（AR）信號通路探討中藥複方PC-SPES Ⅱ抑製人前列腺癌細胞LNCaP增殖的作用。采用MTT法檢測PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞增殖的影響，顯示PC-SPES Ⅱ質量濃度為180～1 440 mg·L-1時能顯著抑製LNCaP細胞增殖，PC-SPES Ⅱ作用24，48 h的IC50分別為311.48，199.01 mg·L-1；流式細胞儀檢測細胞周期分布的變化發現240 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ能阻滯細胞於G2/M期，在G0/G1峰前出現明顯的凋亡峰，隨作用時間的增加而升高；同時采用Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞形態和Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡細胞比例，PC-SPESⅡ質量濃度為480 mg·L-1時凋亡細胞比率增加，作用效果均呈一定劑量依賴性；通過ELISA法檢測LNCaP細胞分泌PSA的水平，以25 mg·L-1 Bic作為陽性對照藥，發現480 mg·L-1PC-SPES Ⅱ能顯著降低細胞分泌PSA；采用qRT-PCR和Western blot方法檢測AR，PSA mRNA和蛋白表達的變化，結果顯示以人工合成雄激素25 μg·L-1R1881誘導LNCaP細胞後，240～480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ能顯著下調AR，PSA mRNA和蛋白表達，抑製AR由細胞質轉移入細胞核。以上結果表明，PC-SPES Ⅱ對LNCaP細胞體外增殖有抑製作用，阻滯細胞周期於G2/M期並誘導細胞凋亡，其機製可能與下調AR，PSA的表達，抑製AR核轉位有關。
[關鍵詞] 前列腺癌；PC-SPES Ⅱ；LNCaP細胞；抑製增殖；雄激素受體；前列腺特異性抗原
[Abstract] To investigate the effect of compound Chinese traditional medicine PC-SPES Ⅱ I in inhibiting proliferation of human prostate cancer cell LNCaP based on the androgen receptor （AR） signaling pathway. The effect of PC-SPES Ⅱ on LNCaP cell proliferation was detected by MTT assay. According to the findings， at the mass concentration of 180-1 440 mg·L-1， PC-SPES Ⅱ significantly inhibited the proliferation of LNCaP cells； the IC50 of PC-SPES Ⅱ at 24 h and 48 h were 311.48， 199.01 mg·L-1， respectively. The flow Cytometry detection showed 240 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ arrested cells in G2/M phase， and an obvious apoptotic peak appeared before G0/G1 peak and rose over time. Meanwhile， Hoechst 33258 staining revealed apoptotic cellular morphology. Annexin V-FITC/PI staining manifested an increase in apoptotic cell ratio at the PC-SPES Ⅱ concentration of 480 mg·L-1 in a dose dependent manner. The prostate specific antigen （PSA） secretion of LNCaP cells was tested by PSA ELISA kit. Besides， compared with 25 mg·L-1 Bic， 480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ significantly reduced the cell secretion of PSA. The AR and PSA mRNA and protein expressions were detected by qRT-PCR and Western blot. According to the results， after the induction of LNCaP cells with synthetic androgen 25 μg·L-1 R1881， 240-480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ _disibledevent=（A實驗組-A空白組）/（A陰性對照組-A空白組）×100%。
2.4 流式細胞儀檢測細胞周期分布 取對數生長期的LNCaP細胞經胰酶消化後， 以5×105個/孔的細胞數接種於6孔板中，每孔2 mL。待細胞貼壁後，陰性對照組加入含0.1%乙醇的培養液，實驗組加入終質量濃度為240 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ，分別於37 ℃，5%CO2培養箱中培養0，12，24，48 h後，消化收集細胞，用預冷PBS洗1次，加入預冷70%乙醇固定細胞，4 ℃過夜。離心棄上清，用預冷PBS洗1次，加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer，室溫孵育15 min。使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。
2.5 Hoechst 33258染色觀察凋亡細胞形態 取對數生長期的LNCaP細胞經胰酶消化後， 以1×105個/孔的細胞數接種於24孔板中，每孔1 mL。待細胞貼壁後，陰性對照組加入含0.1%乙醇的培養液，實驗組加入終質量濃度為480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ，分別於37 ℃，5%CO2培養箱中培養0，12，24，48 h後，棄培養上清，用預冷PBS洗1次，加入預冷95%乙醇固定細胞，4 ℃過夜。棄固定液，用預冷PBS洗2次，加入Hoechst 33258，37 ℃染色15 min，用預冷PBS洗2次，於倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。
2.6 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數生長期的LNCaP細胞經胰酶消化後， 以5×105個/孔的細胞數接種於6孔板中，每孔2 mL。待細胞貼壁後，陰性對照組加入含0.1%乙醇的培養液，實驗組加入終質量濃度為480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ，分別於37 ℃，5%CO2培養箱中培養0，24，48 h後，胰酶（不含EDTA）消化收集細胞，用預冷PBS洗2次，重懸細胞於Binding buffer中，按照試劑盒說明加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，室溫孵育15 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，其中Annexin V陽性，PI陰性代表早期凋亡細胞，Annexin V陽性，PI陽性代表晚期凋亡細胞。
2.7 ELISA法測定細胞分泌PSA水平 取對數生長期的LNCaP細胞經胰酶消化後， 分別以1×105個/孔細胞傳於24孔板中，每孔1 mL。待細胞貼壁後，陰性對照組加入含0.1%乙醇的培養液，陽性對照組加入終質量濃度為25 mg·L-1Bic，實驗組加入終質量濃度為480 mg·L-1PC-SPES Ⅱ，培養0，12，24，48 h後，分別收集每孔細胞培養上清，按照人前列腺特異性抗原ELISA試劑盒說明操作，多功能酶標儀在450 nm處檢測吸光度A。
2.8 qRT-PCR檢測細胞AR，PSA mRNA的表達 取對數生長期的LNCaP細胞經胰酶消化後， 以5×105個/孔的細胞數接種於6孔板中，每孔2 mL。待細胞貼壁後，陰性對照組加入含0.1%乙醇的培養液，實驗組均加入終質量濃度25 μg·L-1R1881，分別加入終質量濃度為240，480 mg·L-1 PC-SPES Ⅱ或25 mg·L-1 Bic，於2%FBS RPMI-1640中培養24 h後，消化收集細胞。按照Trizol試劑說明提取細胞總RNA，所提取的RNA用NanoDrop 2000（美國Thermo公司）測定濃度，並根據A260/A280（1.8～2.0）確定總RNA提取的純度。根據RNA濃度取1 μg RNA逆轉錄，合成cDNA，所得逆轉錄產物用於PCR擴增。通過Primer-Blast和Primer Premier 5.0設計引物，引物序列及擴增產物長度，引物由上海生工合成。qPCR反應條件為95 ℃預變性10 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。β-actin作為內參基因，目的基因的相對表達量根據2-ΔΔCt計算，同時參考溶解曲線確保擴增產物的特異性。